HBV X基因对成人肝细胞HL7702线粒体功能的影响

作者：林纳, 李 丹, 陈红英, 陈治新, 王小众。

【摘要】 目的: 研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。 方法: 将HBV X基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞, 经过2周G418筛选, 获得稳定表达的新细胞株, 分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3, RTPCR和Western blot方法证实HBV X基因在HL7702/HBx细胞内的稳定表达。抽提细胞总RNA进行半定量RTPCR及分离细胞线粒体进行Western blot检测COX Ⅲ 表达水平变化, 并通过酶动力学方法检测线粒体细胞色素氧化酶活性。结果: 重组质粒pcDNA3X转染后经G418筛选, RTPCR和Western blot分析结果显示HL7702HBx细胞能够稳定表达HBV X基因。RTPCR和Western blot结果发现HBV X基因下调COX Ⅲ 蛋白表达而不影响mRNA水平表达。酶动力学检测发现线粒体细胞色素C氧化酶活性降低。结论: HBV X基因通过转录后水平调节COX Ⅲ表达, HBx通过与COXⅢ相互作用抑制线粒体细胞色素氧化酶活性。

【关键词】 HBx; COX Ⅲ; 线粒体细胞色素氧化酶。

［Abstract］ AIM: To study the effect of HBx on a new HBxinteracted protein COXⅢ and mitochondria. METHODS: A recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3X was constructed, then pcDNA3X and pcDNA3 were steadily transfected in HL7702 separately, named HL7702/HBx and HL7702/pcDNA3. The expression of COXⅢ in HL7702/HBx, HL7702/pcDNA3 and HL7702 cells were detected by RTPCR and western blot. Mitochondrial cytochrome c oxidase activities of three groups were assayed spectrophotometrically at 550 nm by using partially purified mitochondria. RESULTS: COXⅢ mRNA expression didn’t change, while protein expression is downregulated in HL7702/HBx. Cytochrome c oxidase activity was much lower in HL7702/HBx compared with HL7702 and HL7702/pcDNA3 cells. CONCLUSION: HBx can downregulate COXⅢ expression through posttranscriptional level and inhibit mitochondrial cytochrome c oxidase activity.

［Keywords］HBx; COXⅢ; cytochrome c oxidase。

［摘 要］ 目的: 研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。 方法: 将HBV X基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞, 经过2周G418筛选, 获得稳定表达的新细胞株, 分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3, RTPCR和Western blot方法证实HBV X基因在HL7702/HBx细胞内的稳定表达。抽提细胞总RNA进行半定量RTPCR及分离细胞线粒体进行Western blot检测COX Ⅲ 表达水平变化, 并通过酶动力学方法检测线粒体细胞色素氧化酶活性。结果: 重组质粒pcDNA3X转染后经G418筛选, RTPCR和Western blot分析结果显示HL7702HBx细胞能够稳定表达HBV X基因。RTPCR和Western blot结果发现HBV X基因下调COX Ⅲ 蛋白表达而不影响mRNA水平表达。酶动力学检测发现线粒体细胞色素C氧化酶活性降低。结论: HBV X基因通过转录后水平调节COX Ⅲ表达, HBx通过与COXⅢ相互作用抑制线粒体细胞色素氧化酶活性。

［关键词］HBx; COX Ⅲ; 线粒体细胞色素氧化酶。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）慢性感染是导致肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要危险因子, HBV X基因全长转录体编码的X蛋白（HBx）含154个氨基酸, 相对分子质量(Mr)约为16 500。X基因及其产物HBx在肝炎病毒慢性感染过程中直接或间接促进HCC的发生、 发展。目前, HBx的亚细胞定位尚存在争议。Henkler等［1］发现X蛋白在低表达的细胞中完全或绝大部分定位于细胞核内, 而过量表达的X蛋白则分布于胞质中。另有学者观察到HBx在细胞质内的水平高于细胞核, 且细胞质中的HBx主要分布于线粒体外膜上［2］。

目前已证实HBx并不直接作用于双链DNA, 主要通过与细胞内多种蛋白质相互作用影响细胞的生物学功能, 故研究体内X结合蛋白对阐明X蛋白的作用及机制有重要作用。我们前期研究已经通过酵母双杂交体系从成人正常肝细胞cDNA文库中筛选出一种新的X结合蛋白细胞色素c氧化酶Ⅲ（cytochrome c oxidase Ⅲ, COXⅢ）［3］。细胞色素c氧化酶复合体是最具特征的呼吸链酶复合体, 由13个亚基组成, COXⅢ在复合酶的聚集和稳定性中起重要作用, 并参与质子的传递和细胞色素c氧化酶介导的能量转换［4］。

我们以成人肝细胞HL7702为研究对象的, 通过构建HBV X基因真核表达载体pcDNA3X, 并将其稳定转染给HL7702细胞, 检测HBx与COXⅢ的相互作用以及由此引起的线粒体结构和功能变化, 进一步阐明HBV的致癌机制。

1 材料和方法。

1.1 材料 质粒抽提试剂盒购自深圳生物晶美公司、 pcDNA3表达载体购自Invitrogen公司; 重组HBV X基因真核表达载体pcDNA3X由本实验室保存。成人肝细胞株HL7702购自中科院上海细胞库, DMEM、 F12和胰蛋白酶购自Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司; 逆转录试剂盒, JetPEITMGal转染试剂盒购自法国Polyplus transfection公司, TRIzol试剂购自Invitrogen公司; 线粒体抽提试剂盒购自Piecer公司; 线粒体细胞色素氧化酶活性检测试剂盒购自美国Sigma公司。小鼠抗人乙肝病毒X蛋白购自Chemicon公司, 山羊抗人COXⅢ多克隆抗体、 小鼠抗人βactin单克隆抗体（mAb）购自美国Santa Cruz公司, 兔抗小鼠二抗、 马抗山羊二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司, Western blot实验的ECL显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法。

1.2.1 寡核苷酸引物设计 根据HBV X、 GAPDH、 COXⅢ基因序列自行设计引物, 由Invitrogen公司合成。HBV X基因上游引物5′ATGCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTACTG3′, 下游引物5′TGCGAATTCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG3′, 产物467 bp; GAPDH基因上游引物5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′, 下游引物5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′, 产物452 bp; COX III基因上游引物: 5′AGCCCATGACCCCTAACA3′, 下游引物5′CCTCATAGTTAGTGGACTCG3′, 产物463 bp。

1.2.2 重组pcDNA3X质粒稳定转染HL7702细胞 HL7702细胞生长于含100 mL/L 胎牛血清的DF （DMEM∶F12=3∶1）培养液中, 采用JetPEITMGal转染试剂盒将质粒pcDNA3和重组真核表达载体pcDNA3X转入HL7702肝细胞株中, 命名为HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx, 步骤如下: 选取对数生长期细胞, 消化接种于25 cm培养瓶, 细胞数为1×106/L, 待细胞贴壁后, 即可进行转染。取2支无菌试管, 分别加入5 μg DNA和16 μL JetPEI, 以250 μL NaCl（150 mmoL/L）稀释, 轻轻涡旋, 将JetPEI加入DNA中, 轻轻混匀, 室温孵育30 min。将细胞内培养液倒去, 加入新鲜培养液及500 μL DNA/JetPEI混合液, 轻轻摇匀, 继续培养48 h。转染结束后将细胞消化移入6孔板, 加入终浓度为800 μg/L G418进行筛选, 2周后分别获得单克隆细胞1株, 命名为HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx。

1.2.3 X基因在转染细胞中的表达 分别抽提HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx 3组细胞总RNA, 逆转录为cDNA。取cDNA 1 μL作为模板, 扩增HBV X基因片段。HBV X基因引物序列如上所述, PCR反应条件为94℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 经25个循环。扩增产物在18 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 观察结果。

取对数生长期HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx 3组细胞, 4℃预冷PBS洗涤细胞2次, 加入100 μL细胞裂解液（50 mmoL/L的TrisHCl, pH6.8, 100 mmoL/L二硫苏糖醇, 20 g/L十二烷基硫酸纳, 100 g/L甘油）, 所得溶液在沸水中煮10 min, 15 000 g离心10 min, 取上清即为细胞总蛋白溶液。测定蛋白浓度, 取50 μg总蛋白上样, 进行120 g/L SDSPAGE电泳, 经硝酸纤维素膜转移, 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液（TBS+1 mL/L Tween20）封闭后, 分别与小鼠抗人HBx mAb（1∶100）4℃孵育过夜, 洗涤后再与山羊抗小鼠二抗（1∶2 500）作用1 h, 经ECL底物化学发光显影, 测量胶片中条带灰度值。

1.2.4 COXⅢ基因在转染细胞中的表达变化 分别抽提HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx 3组细胞总RNA, 逆转录为cDNA。取cDNA 1 μL作为模板, 以GAPDH为内参扩增COXⅢ 基因片段。引物序列如上所述, PCR反应条件为94℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 经25个循环。扩增产物在18 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 观察结果。

分别取对数生长期HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx细胞, 梯度离心法分离线粒体和胞质蛋白。以2×蛋白上样缓冲液稀释线粒体和胞质蛋白, 煮沸变性后进行100 g/L SDSPAGE电泳, 经硝酸纤维素膜转移, 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液（TBS+1 mL/L Tween20）封闭后, 分别与山羊抗人COXⅢ 多克隆抗体（1∶100）及小鼠抗人βactin mAb（1∶300）4℃孵育24 h, 洗涤后再分别与马抗山羊二抗（1∶2 000）和山羊抗小鼠二抗（1∶2 500）作用1 h, 经ECL底物化学发光显影, 测量胶片中条带灰度值。

1.2.5 细胞色素C氧化酶（COX）活性在转染细胞中的变化 真核细胞的细胞色素C氧化酶通过与电子耦合为细胞提供能量。细胞色素C氧化酶的底物为细胞色素C, 在酶促反应过程中, 随着底物被氧化, 反应溶液550 nm吸光度呈逐渐下降趋势, 通过检测A550下降速率可反映细胞色素C氧化酶活性。取对数生长期HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx细胞, 消化离心收集细胞约1×107/L, 分离线粒体。将线粒体重悬于1.05 mL氧化酶稀释液中, 加入50 μL 反应底物细胞色素C, 颠倒混匀, 紫外分光光度仪, 550 nm检测反应溶液A550值, 间隔2 s检测1次, 共2 min, 根据A550值变化计算细胞色素C氧化酶活性。