血管生成素—1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究
【摘要】 目的：探讨人血管生成素—1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165）共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法：应用复制缺陷型腺病毒（Ad）—绿色荧光蛋白（GFP）、Ad—Ang1、Ad—VEGF165和Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC—803，使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响；通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响；使用免疫细胞化学法检测Ki—67的表达；应用RT—PCR方法半定量检测bcl—2 mRNA、bax mRNA的表达情况。结果：MTT结果显示24、48和72 h Ad—Ang1转染组、Ad—VEGF165转染组和Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad—GFP组及对照组(P0.05)；Ad—GFP组与对照组相比无显著差异(P0.05)；Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad—Ang1转染组和Ad—VEGF165转染组(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad—Ang1、Ad—VEGF165及Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki—67表达强度均显著高于对照组和Ad—GFP组(P0.01)。RT—PCR结果显示bcl—2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P0.05)；bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P0.05)。结论：Ang1、VEGF165和Ang1+VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC—803增殖，抑制血浆饥饿时的凋亡，Ang1+VEGF165/2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。
【关键词】 血管生成素—1； 血管内皮生长因子165； Ki—67； 胃癌； 增殖； 凋亡。
血管生成素1（angiopoietin—1,Ang1）被发现在肿瘤的转移、血管生成和肿瘤的侵袭中发挥重要作用，目前研究较多集中于其对肿瘤血管生成的作用上。Ang1是否能够对肿瘤细胞产生作用，以及Ang1和血管内皮生长因子165（VEGF165）是否能够协同作用于肿瘤细胞，目前并无相关研究。本实验以腺病毒为载体，将Ang1、VEGF165转染至人胃癌细胞株MGC—803，研究其对胃癌细胞株体外增殖和凋亡的影响。
1 材料和方法。
1.1 材料。
人胃腺癌细胞株MGC—803购自中国科学院，复制缺陷型腺病毒（Ad）重组体Ad—Ang1、Ad—VEGF165及对照病毒Ad—绿色荧光蛋白（GFP）由南京医科大学第一附属医院构建并赠送，Annexin Ⅴ—FITC/PI试剂盒购自Bender Medsystems公司。
1.2 方法。
1.2.1 细胞培养 MGC—803细胞用含有10％胎牛血清的1640培养液于37 ℃、5%CO2 的培养箱中培养，培养基中含100 U·ml—1青霉素和链霉素。
1.2.2 MTT法测定Ad—Ang1、Ad—VEGF165以及Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2对MGC—803细胞增殖的影响 实验分对照组(正常细胞组)、Ad—GFP组(平行对照组)、Ad—Ang1组(Ang1转染组)、Ad—VEGF165组(VEGF165转染组)、Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组(Ang1、VEGF165联合转染组)5组，每组设3个复孔。取对数生长期的MGC—803细胞，以8 000个·孔—1接种细胞于96孔培养板中，细胞生长度达60%～70%时对Ad—GFP、Ad—Ang1和Ad—VEGF165等3组予相应的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液100 μl感染，Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组加入相应的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液50 μl感染，感染8 h后换RPMI 1640完全培养液继续培养，对照组加入无血清的RPMI 1640培养液。分别于感染后24、48、72 h测定每孔吸光度(A值)，以空白对照孔的A值调零。
1.2.3 流式细胞仪检测转染Ang1、VEGF165、Ang1+VEGF165/2对MGC—803凋亡的影响 将MGC—803以1.0×105个·孔—1接种于6孔板，实验分组同“1.2.2”，每组设3个复孔。感染8 h后用无血清培养液继续培养48 h后收集对照组、Ad—GFP组、Ad—Ang1组、Ad—VEGF165组和Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组的MGC—803 细胞，1 000 r·min—1 4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 ml冷的PBS， 轻轻震荡使细胞悬浮，1 000 r·min—1 4 ℃离心10 min，弃上清，重复用冷的PBS洗两次。将细胞重悬于200 μl结合缓冲液，加入10 μl Annexin Ⅴ—FITC和5 μl PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μl结合缓冲液，在1 h内上机检测细胞的凋亡率。
1.2.4 免疫细胞化学方法检测Ki—67在MGC—803细胞中的表达 取对数生长期的MGC—803细胞，消化后计数并调整培养液用量，使细胞悬液终浓度为1.0×105ml—1，接种至底部有小玻片的6孔板中，每孔2 ml细胞悬液，置孵育箱中培养。次日细胞在小玻片上贴壁生长约60%融合，分别于每孔加入Ad—GFP、Ad—Ang1、Ad—VEGF165和Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液1 ml感染，感染8 h后换RPMI 1640完全培养液继续培养，另两孔中不加病毒作为对照组。再于48 h后取出小玻片用丙酮固定,PBS缓冲液冲洗，30 ml·L—1双氧水灭活内源性过氧化酶，微波抗原热修复后正常山羊血清封闭，一抗4 ℃过夜孵育，二抗30 min，DAB显色，复染核、脱水、透明，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。胞核见棕黄色颗粒为阳性。应用Image—pro plus图像分析软件进行分析，每组选取10个高倍镜视野，用平均光强度表示Ki—67的相对表达量。
1.2.5 RT—PCR半定量检测bcl—2 mRNA、bax mRNA Trizol法提取对照组、Ad—GFP组、Ad—Ang1组、Ad—VEGF165组和Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组细胞的RNA，琼脂糖凝胶电泳初步评价RNA的质量，分光光度仪测定总RNA纯度。按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RT—PCR操作，根据RNA纯度将每组的RNA调至每个反应体系中含1 μg。bcl—2引物上游序列为5′—GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA—3′，引物下游序列为5′—AGGCACCCAGGGTGATGCAA—3′，扩增产物为304 bp；bax引物上游引物序列为5′—GACGAACTG GACAGTAACATG—3′，引物下游序列为5′—AGGAAGTC CAATGTCCAGCC—3′，扩增产物为230 bp；GAPDH引物上游序列为5′— CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA—3′，引物下游序列为5′—TCTAGACGGCAGGTCAGGTC CAC—3′，扩增产物为598 bp。对RT—PCR产物进行琼脂糖电泳，数字成像系统进行拍照分析。
1.3 统计学处理。
实验结果以均数±标准差表示，均数间比较采用t检验。所有数据均采用SAS 8.2统计软件进行分析，P＜0.05表示有显著性差异。
2 结 果。
2.1 MTT法测定转染Ang1、VEGF165、Ang1+VEGF165/2对MGC—803细胞增殖的影响 培养24、48和72 h所得的各组A值见表1。由表1可见，Ad—GFP组与对照组比较，细胞增殖率差异无统计学意义(P0.05)；Ad—Ang1、Ad—VEGF165、Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组与对照组和Ad—GFP组相比，能够明显促进细胞增殖(P0.05)； Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组与Ad—Ang1组和Ad—VEGF165组相比，其促增殖作用明显增强(P0.05)。表1 MTT法测定VEGF165、Ang—1转染对MGC—803细胞增殖的影响1)与对照组和Ad—GFP组比较，P0.01；2)与对照组和Ad—GFP组比较，P0.05;3)与Ad—Ang1组和Ad—VEGF组比较，P0.05。
2.2 转染Ang1、VEGF165以及Ang1+ VEGF165/2对MGC—803细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果表明（图1）,对照组、Ad—GFP组、Ad—Ang1组、Ad—VEGF165组、Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组的凋亡率分别为(10.40±0.36)%、(9.77±0.42)%(与对照组比,t=1.99、P=0.117 2)、(6.76±0.25)%（与对照组比,t=19.3、P=0.000 1;与Ad—GFP组比，t=10.68、P=0.000 4)、(7.07±0.15)%（与对照组比,t=21.57、P=0.000 1；与Ad—GFP组比，t=10.55、P=0.000 5)、(4.17±0.15)%（与对照组比,t=38.63、P0.000 1;与Ad—GFP组比，t=21.87、P0.000 1;与Ad—Ang1组比,t=15.3、P=0.000 1;与Ad—VEGF165组比,t=23.25、P0.000 1)。
A.对照组;B.Ad—GFP组;C.Ad—Ang1组;D.Ad—VEGF165组;E.Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组。
图1 转染Ang1、VEGF165和Ang1+VEGF165/2对人胃癌细胞MGC—803凋亡的影响。
2.3 转染Ang1、VEGF165以及Ang1+ VEGF165/2各组中Ki—67的表达情况 Ki—67表达以细胞核呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，单纯的细胞浆着色而细胞核无着色或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。对照组、Ad—GFP组、Ad—Ang1组、Ad—VEGF165组和Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组平均光强度值依次为0.389±0.006、0.398±0.008、0.585±0.004、0.595±0.006和0.699±0.007。结果显示，Ki—67表达对照组与Ad—GFP组比较差异无显著性(P0.05)，对照组与Ad—Ang1组、Ad—VEGF165组、Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组比较差异有显著意义(P0.01)， Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组与Ad—Ang1组及Ad—VEGF165组比较差异有显著意义(P0.01)。见图2。
A.对照组;B.Ad—GFP组;C.Ad—Ang1组;D.Ad—VEGF165组;E.Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组。
图2 Ki—67在各组的表达情况。
2.4 转染Ang1、VEGF165以及Ang1+VEGF165/2各组bcl—2 mRNA、bax mRNA表达情况的变化 扩增出的目的基因为一条带，片段长度为304 bp(图3)。扩增的目的条带也为1条，片段长度为230 bp(图4)。Bcl—2 mRNA在各处理组的表达与对照组及Ad—GFP组相比明显增强(P0.05)，其中Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组表达最强；bax mRNA在各处理组的表达与对照组及Ad—GFP组相比明显降低(P0.01),Ad—Ang1+Ad—VEGF165/2组的表达最弱。