胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系
作者：翟瑜 李勇 苏力 范立侨 脱红芳 郭贵军。
【摘要】 目的 从分子水平上，探讨细胞角蛋白(CK6、CK18)联合检测在胃癌淋巴结微转移中的诊断价值和临床意义。方法 应用RTPCR方法，以CK6、CK18为标志基因，检测正常胃黏膜60例，原发胃癌组织60例，胃癌组无转移淋巴结(PNo)180枚，比较其表达差异以及与临床病理参数之间的关系。结果 ①60例正常胃黏膜中几乎无CK6、CK18的表达；②原发胃癌组织和其相应的淋巴结转移灶中CK6、CK18的表达相一致；③CK6在淋巴结转移灶中的表达水平低于原发癌中的表达水平，而CK18则相反；④CK6阳性多在WHO分型中的高分化腺癌及其他特殊类型癌组织中存在；在芬兰Lauren分类中，CK6多在肠型胃癌组织和淋巴转移灶中表达；⑤CK6的表达与较好的分化程度，较轻的病变进展，较浅的肿瘤浸润、较早的肿瘤分期有关；⑥CK18多表达在胃腺癌中；⑦CK18在较晚期的肿瘤中表达较多；⑧CK18淋巴结微转移多发于pTNM三期以上的肿瘤；⑨在原发肿瘤以及淋巴结转移灶中，CK6、CK18的表达与患者的性别、年龄无明显统计学差异。结论 用RTPCR法检测胃癌无转移淋巴结CK6、CK18 mRNA是发现胃癌淋巴结微转移敏感而特异的方法，对胃癌临床分期及指导治疗有较大的临床意义。
胃癌的微转移是指恶性肿瘤在发展过程中，肿瘤细胞播散并存活于血液循环、淋巴道、骨髓及组织器官中，而未形成转移结节，其特点是无任何临床表现，且常规检查方法，如影像、病理等均难以发现〔1〕，是胃癌根治术后复发及胃癌患者治疗失败和生存率低的原因之一〔2，3〕。因微转移灶多数小于2 mm，所以通过传统组织学检查癌旁淋巴结并不能诊断出全部微转移〔4，5〕，不过随着现代分子生物学技术的发展和新的肿瘤标志物的发现，微转移的检测方法也在不断的更新。本文即应用反转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测胃癌无转移淋巴结（PN0）中细胞角蛋白6（CK6）及细胞角蛋白18（CK18）的表达，对于临床上指导治疗，预测复发，评价预后提供理论依据。
1 材料与方法。
1.1 研究对象 标本均取自2007年6月～2007年8月河北医科大学第四医院普外科行胃癌手术切除的病例，共60例，其中男38例，女22例。年龄52～72〔平均（61.2±8.4）〕岁。每个病例取肿瘤中心部位的癌组织及远离癌组织5 cm以上的正常胃黏膜，以及淋巴结8～15枚（平均10枚）。每枚淋巴结一半送病理，一半保存，从中选取病理检查结果为阴性的淋巴结3枚。离体标本手术切除后立即置于液氮中，后转移至—80℃低温冰箱中保存。
1.2 引物设计 引物由南京斯迈特公司合成。CK6、CK18引物的序列设计，见表1。
表1 引物序列、产物大小及GenBank 号（略）。
1.3 总RNA抽提及鉴定 60例胃癌组织，180枚淋巴结和60例正常组织中分别加入提取试剂(Invitrogen)1 ml，电动匀浆1～2 min，匀浆液室温放置5 min后加氯仿200 μl，振荡15 s，12 000 r/min 4℃离心15 min；上层水相移至另一Eppendorf 管，加异丙醇500 μl，混匀室温放置10 min，12 000 r/min 4℃离心15 min；弃掉上清加1 ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，7 500 r/min 4℃离心5 min；弃掉上清，空气干燥RNA沉淀10 min；用适量焦磷酸二乙酯(DEPC)处理过的水溶解PNA。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量。测定RNA 纯度、浓度及完整性。以总RNA为模板，经逆转录得到cDNA。
1.4 RTPCR RTPCR总反应体系25 μl。用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作内参照，将PCR Mix混匀后进行扩增。CK6预变性94℃ 5 min；PCR扩增（35个循环）94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 7 min。CK18预变性94℃ 5 min；PCR扩增（35个循环）94℃ 30 s，72℃ 1 min；延伸72℃ 7 min。GAPDH预变性94℃ 5 min；PCR扩增（30个循环）94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 7 min。上、下游引物见表1，反应体系见表2。
1.5 结果观察 PCR产物在加溴化乙锭的2.0%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶图像分析系统上观察结果并拍照。作为内参引物的GAPDH片段长度为230 bp，CK6、CK18基因扩增片段分别为164和154 bp。若在相应位置出现DNA条带，则CK6或CK18 mRNA表达阳性，淋巴结存在微转移〔6〕。
表2 聚合酶链反应体系（略）。
1.6 统计学处理 采用χ2检验，以实验数据的95%可信区间为正常值范围。数据处理通过统计软件SPSS10.0完成。
2 结果。
2.1 各组CK6和CK18阳性表达比较 60例正常胃黏膜中无CK6、CK18的表达；胃癌组织中CK6的阳性率为21.7%（13/60），CK18的阳性率为63.3%（38/60），CK18显著高于CK6的表达;常规病理学检查未发现转移的180枚淋巴结(PN0)中，经RTPCR方法检测，发现有22枚淋巴结CK6 mRNA表达阳性，阳性率为12.2%，有128枚淋巴结CK18 mRNA表达阳性，阳性率为71.1%；其差异具有统计学意义(P＜0.005)。图1。
M:标志物 C:肿瘤组织 L:淋巴结 图1 CK6和CK18在胃癌组织及淋巴结中的表达（略）。
2.2 CK6和CK18表达相关性分析 原发胃癌组织中表达CK6、CK18的病例，其淋巴结转移灶中CK6、CK18也多为阳性，即原发胃癌组织和其相应的淋巴结转移灶中CK6、CK18的表达相一致(P＜0.005)。原发肿瘤灶和淋巴结CK6均阳性的11例，均阴性的44例；原发灶和淋巴结CK18均阳性的29例，均阴性的18例，表达相一致。CK6原发灶阳性而淋巴结阴性的2例，原发灶阴性而淋巴结阳性的3例；CK18原发灶阳性而淋巴结阴性的9例，原发灶阴性而淋巴结阳性的4例(P＜0.005)。见表3。
表3 原发肿瘤和淋巴结转移灶中CK6、CK18表达的一致性（略）。
2.3 CK6和CK18阳性表达与临床病理参数的关系 CK6阳性多在WHO分型中的高分化腺癌(40.00%)(P＜0.05)以及诸如腺鳞癌、鳞状细胞癌等其他特殊类型癌组织(66.67%)(P＜0.05)中存在。而相应的淋巴转移灶中CK6的阳性率分别为22.22%和33.33%(P＜0.05)；在芬兰Lauren分类中，CK6多在肠型胃癌组织和淋巴转移灶中表达，阳性率为41.67%(P＜0.01)和23.61%(P＜0.005)。 在癌肿直径≤3 cm、仅侵及黏膜层以及Ⅰ～Ⅱ期病例胃癌组织中，CK6的表达也较明显，分别为50.00%(P＜0.025)，54.54%(P＜0.01)和30.77%(P＜0.025)。而淋巴结转移灶中的比值分别为27.78%(P＜0.01)，30.30%(P＜0.005)和16.24%(P＜0.025)。胃癌淋巴结微转移CK6阳性率与肿瘤临床病理参数浸润(T)呈负相关。CK18在胃癌原发肿瘤及淋巴结转悠灶中均有较高水平的表达，分别为63.3%和71.1%。在胃腺癌中，CK18阳性率较高，为78.57%(P＜0.005)，相应淋巴结转移灶中阳性率为85.71%(P＜0.005)。可见，CK18多在胃腺癌中表达。CK18的阳性率在直径大于6 cm的肿瘤中为76.92%(P＜0.01)，侵及周围软组织的肿瘤中为80%(P＜0.01)，Ⅲ～Ⅳ肿瘤中为85.71%(P＜0.01)。胃癌淋巴结微转移CK18阳性多发于肿瘤直径大于6 cm(76.92%和87.18%)(P＜0.01)，侵及肌层(80.39%)和周围软组织(86.67%)(P＜0.005)，pTNM三期以上(82.54%)的肿瘤(P＜0.01)。胃癌淋巴结微转移CK18阳性率与肿瘤临床病理参数浸润(T) 呈正相关。在原发肿瘤以及淋巴结转移灶中，CK6、CK18的表达与患者的性别、年龄无明显统计学差异(P＞0.05)。见表4。
3 讨论 胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，采用根治性手术治疗的5年生存率，进展期胃癌为40%，早期胃癌为90%。患者多死于复发和转移〔7〕。这说明部分患者在治疗时已存在目前形态学诊断技术所不能确定的转移，即微转移。近年来，随着分子生物学技术的发展，拓宽了微转移诊断的途径。