组织工程骨神经化构建的组织学研究

作者：刘勇，裴国献　江汕，姚旺祥，任高宏，孙新君。

【摘要】 [目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化，探讨组织工程骨神经化构建的效果。[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞，与β磷酸三钙(βtricalcium phosphate，βTCP)复合制作组织工程骨，分别将不同类型神经束植入组织工程骨，进行以下分组：A组，组织工程骨组; B组，感觉神经束植入组; C组，运动神经束植入组; D组，血管束(含有自主神经)植入组; E组，感觉、运动神经束联合植入组。分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色，降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide,CGRP)的免疫组织化学检测，并进行统计学分析，以比较骨缺损修复情况。[结果]在观察期内，有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用，而运动神经束植入却没有明显的促进作用。[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用，可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法。

【关键词】 组织工程骨; 神经化; 骨缺损。

Abstract：[Objective]To study the ossification effect by histology research on tissue engineered bone by transplanting nerval bundles of different types.[Method]The Newzeland rabbit BMSCs (bone marrow stromal cells，BMSCs) were induced to osteoblast and compounded with βTCP (βtricalcium phosphate，βTCP)to make tissue engineered bones,and different kinds of nerval bundles were transplanted into these tissue engineered bone.All Newzeland rabbits were divided into 5 groups according to different types of nerval bundles:Group A,tissue engineered bones without nerval bundles transplantation.Group B,tissue engineered bones transplanted with sensory nerval bundles.Group C,tissue engineered bones transplantation with motor nerval bundles.Group D,tissue engineered bones transplanted with vascular bundles (autonomic nerves contained).Group E,tissue engineered bones transplantation with both sensory and motor nerval bundles.Then,1.5 cm bone defect in femur of Newzeland rabbits were repaired.At 12 week,gross specimen observation,histology studies and immunohistochemistry were used to compare the results of bone repair in different groups.[Result]During the observation period,tissue engineered bones transplanted with sensory and vascular bundles effectively accelerated the ossification of the tissue engineered bones,while those transplanted with motor nerval bundles did not.[Conclusion]Sensory nerval bundles and vascular bundles can effectively accelerate the ossification of tissue engineered bones.They can be used as a construction method for nervalization after tissue engineered bone.

Key words：tissue engineered bone; nervalization; bone defect。

在组织工程学领域，组织器官的构建最终目的是获得一个有功能的组织和器官。这样，构建的组织、器官的血管、神经化成为其在体内存活和发挥功能的关键因素。神经在正常骨组织中的分布及在骨组织代谢等方面的研究表明神经因素对骨的发育、修复、改建等有显著作用。为探索组织工程骨神经化构建的方法，设想利用显微外科技术，将感觉神经、运动神经和血管束(包含与血管伴行的自主神经)分别植入大段组织工程骨，并用以修复兔股骨大段骨缺损来分别验证不同种类神经在构建大段组织工程骨的作用，为进一步深入研究和走向临床探讨一种构建组织工程骨神经化的方法。

1 材料与方法。

1.1 材料。

1.1.1 实验动物 健康新西兰大白兔30只(由南方医科大学南方医院动物所提供),6个月龄，雌雄不限，体重2～3 kg。

1.1.2 材料与试剂 多孔βTCP(圆柱状，直径8 mm，长15 mm，中间有侧槽,由法国贝奥路公司提供)，四孔普通钢板(长6.5 cm，螺钉3.5 mmф)， 电钻，线锯，手术包，胎牛血清(Hyclone)，DMEM培养基、胰蛋白酶、抗坏血酸、地塞米松、β—甘油磷酸钠均购自Sigma公司，多克隆羊抗兔CGRP抗体、及过氧化物酶标记的兔抗羊IgG均购自Chemican公司，SABC试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2 实验方法。

1.2.1 实验动物分组 随机分为5组，每组6只动物。A组：组织工程骨组; B组：感觉神经束植入组; C组：运动神经束植入组; D组：血管束(含有自主神经)植入组; E组：感觉、运动神经束联合植入组。

1.2.2 组织工程骨的制备方法 成年新西兰大白兔30只(在培养过程中因各种原因死亡的动物如数补足)，采用速眠新、氯胺酮和阿托品复合液肌肉注射麻醉。细胞的获取、培养、诱导及与βTCP材料的复合参考文献[1],制作组织工程骨备用。

1.2.3 兔股骨15 mm骨缺损模型的制备方法 作者先前的研究显示兔股骨15 mm缺损自身不能修复，是理想的负重骨缺损的动物模型[2]。于兔右侧后肢股骨前外侧做一纵形切口，长约8 cm,切开皮肤、皮下组织和深筋膜，沿股直肌与股内侧肌间隙锐性分开，显露股骨。不切开骨膜,于股骨前外侧放置已塑形(钢板预弯一定的弧度，约5°～8°，以使钢板和股骨向前外凸的弧度相吻合)好的4孔普通钢板，电钻钻孔后依次旋入4枚螺钉固定，并在两边两个螺钉之间各加用一根细钢丝环扎固定。于钢板第2、3孔之间，以线锯锯断股骨一侧，用直尺测量股骨1.5 cm长,并标记好另一端截骨线，线锯锯断，并切除该段对应的骨膜，造成1.5 cm段骨缺损与骨膜缺损。于骨缺损处嵌入复合细胞的βTCP，并用丝线与钢板固定。然后分别进行以下操作制作5组实验动物模型： A组，在股骨内侧切口，直到股骨处，以增加对照的同一性。B组，在股骨内侧切口，寻找并将感觉神经(隐神经)游离足够的长度，锐性切断，将隐神经束末端用显微剪刀分成爪状植入βTCP材料复合物的侧槽内，用丝线于神经外膜上缝一针固定于周围组织。C组，在股骨根解剖出由股神经发出的支配股内侧肌的肌支，游离一段长度，锐性切断，末端用显微剪刀分成爪状植入βTCP材料复合物的侧槽内，用丝线于神经外膜上缝一针固定于周围组织。D组，在股骨内侧切口，解剖游离股血管束，游离所需长度后不切断血管，直接将血管束顺行植入βTCP材料复合物的侧槽内。E组，在股骨内侧切口，解剖游离隐神经、运动神经，并锐性切断，末端用显微剪刀分成爪状植入βTCP材料复合物的侧槽内，用丝线于神经外膜上缝一针固定于周围组织。术毕，各组按层缝合切口，包扎。术后青霉素钠40万μ肌注,每日2次，共3 d预防感染。

1.3 检测方法。

1.3.1 组织学观察 在术后12周时取材标本制成切片，进行Masson三色染色，对比观察材料降解、成骨和血管化情况。并用图像分析软件测定新生骨组织在骨缺损区域所占面积。

1.3.2 免疫组织化学染色 在术后12周时取材标本制成切片，进行CGRP的免疫组织化学染色。

1.4 统计学处理。

所有数据用SPSS 13.0软件处理。数据用± s表示。数据差异用完全随机设计的多样本均数比较的方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结 果。

2.1 一般情况。

术后第1 d所有兔的精神状况稍差，进食略减少，活动减少，术肢跛行明显。全身无皮疹及畏寒发热，无血尿。2 d后逐渐恢复正常活动，饮食增加，精神好转。所有实验动物无死亡，有1只术后发生感染，被剔除实验，并补充。

2.2 大体观察。

术后12周取材，见各组的骨缺损均有不同程度的修复，其中，A、C组修复情况最差，骨缺损还未完全修复，骨痂还未完全成熟，骨缺损周围见大量的纤维结缔组织;而B、D、E组已完全修复骨缺损，形成大量的皮质骨结构。