芦荟大黄素苷与DNA相互作用的研究

; ;作者：韦欣煜,梅文杰,刘云军。

【摘要】; 目的 探讨芦荟大黄素苷与DNA的相互作用。方法 采用电子吸收光谱，荧光发射光谱，粘度实验以及凝胶电泳实验进行研究。结果与结论 芦荟大黄素以插入方式与DNA分子结合；较高浓度的芦荟大黄素苷能够使Bel7402肝癌细胞DNA由超螺旋构型转化为缺刻构型。

【关键词】; 芦荟大黄素苷；分子识别；凝胶电泳；DNA。

Abstract:The binding properties of barbaloin to DNA were investigated by UVvisible electron absorption spectrum,fluorescence emission spectrum,viscosity measurement and gel electrophoresis,and insertion of barbaloin to DNA was identified.Higher concentration of barbaloin could convert DNA configuration of hepatoma carcinoma cell Bel7402 from superhelix to indention.

Keywords:barbaloin; molecular recognition; DNA。

芦荟是一种传统的常用中药，用于治疗如烧伤、烫伤等疾病并被广泛应用于食品和化妆品等行业，并被。芦荟大黄素苷(图1)是芦荟块茎的主要成分,异芦荟大黄素苷是植物中的主要存在形式，通过非酶催化转化为芦荟大黄素苷，因此通常得到的是芦荟大黄素苷和异芦荟大黄素苷的混合物［1，2］。芦荟的抗菌、抗炎、抗氧化作用等与芦荟大黄素苷的存在密切相关［3，4］。在生物体内芦荟大黄素苷通过代谢转化为芦荟大黄素而发挥药理作用［5，6］。

图1; 芦荟大黄素苷和异芦荟大黄素苷的分子结构（略）。

Fig.1; The molecular structure of barbaloin and isobarbaloin ; 　　近年来的研究表明，芦荟大黄素具有抑制肿瘤细胞生长的作用［7—12］。研究发现芦荟大黄素能促进人早幼粒HL60白血病细胞P27基因过度表达，并诱导肿瘤细胞凋亡［13］。一般认为DNA是抗肿瘤药物的靶点之一［14］。药物分子可以通过共价结合、插入作用、沟结合方式或静电结合方式与DNA分子缔合，对DNA的构象产生微扰，达到抑制肿瘤生长的目的。 　　本文采用荧光光谱和流体力学方法研究了芦荟大黄素苷与DNA分子的缔合机理。结果表明芦荟大黄素苷能够以插入方式与DNA分子结合；凝胶电泳实验结果表明，光照下芦荟大黄素苷能够使Bel7402肝癌细胞DNA的超螺旋构型发生一定程度的转化。

1; 实验部分。

1.1; 仪器与试剂 　　芦荟大黄素苷由中山大学化学与化学工程学院陆伟刚博士提供;Bel7402肝癌细胞由中山大学肿瘤研究所提供。所用化学试剂均为分析纯，除非另有说明，所有试剂未作任何处理。芦荟大黄素苷用5 mmol/L TrisHCl,50 mmol/L NaCl(pH=7.2)缓冲溶液配制。小牛胸腺DNA（华美公司）；电泳级琼脂糖（Promega公司）。MPS2000型紫外可见光谱计（Shimadzu）；RF2000型荧光分光光度计（Shimadzu）；乌氏粘度计；DYYⅢ4型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.2; 实验方法。

1.2.1; Bel7402肝癌细胞的提取 　　按文献方法［15］进行：收集培养好的Bel7402肿瘤细胞，以磷酸盐缓冲液洗涤,14 000 r/min离心5 min，收集底部白色固体沉淀，重复3次,加入RNase A（20 mg/mL）50 μL和 质量分数为10%的SDS 20 μL，56 ℃孵育2 h,然后加入蛋白酶K（20 mg/mL）35 μL，37 ℃孵育24 h,加入10 mol/L NH4OAc 150 μL和无水乙醇1.2 mL，20 ℃过夜，得到DNA的溶液，离心、干燥后，将DNA溶解在150 μL TrisHCl缓冲溶液中。

1.2.2; 紫外—可见吸收光谱实验 　　在参比池和样品池中分别加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收，当芦荟大黄素苷的电子吸收光谱不再变化，此时吸收滴定达到饱和。

1.2.3; 荧光光谱实验 　　　　在样品池中加入一定体积的芦荟大黄素苷溶液，每次往池中加入一定体积的DNA，直至荧光光谱不再变化。

1.2.4; 粘度实验 　　在(25±0.1) ℃恒温水浴中使用乌氏粘度计测量。DNA的流出时间用数字秒表测量得到，每个样品测量3次，取3次测量的平均值，以(η/η0)1/3芦荟大黄素苷的浓度作图［16］。 　　η = t —t 0 　　η:DNA的粘度；t:DNA溶液的流出时间；t0:缓冲溶液的流出时间；η0:没有加入芦荟大黄素苷时DNA的粘度。

1.2.5; 电泳实验 　　TBE缓冲溶液中、1％的琼脂糖凝胶上进行，电泳电压30 V，电泳40 min，溴乙锭染色，照相。

2; 结果与讨论。

2.1; DNA对芦荟大黄素苷电子吸收光谱的影响 　　电子吸收光谱是研究小分子化合物与生物大分子相互作用的常用方法之一。室温下TrisHCl(pH=7.2)缓冲溶液中，芦荟大黄素苷在300～400 nm之间有一个强的ππ*跃迁，其电子吸收峰的最大值为359 nm。当向溶液中加入小牛胸腺DNA以后，芦荟大黄素苷的电子吸收光谱出现明显减色效应，其电子吸收降低约5％(Δλ＝1 nm)，见图2。

图2; 芦荟大黄素苷与DNA作用的紫外可见光谱变化图（略）。

Fig.2; The electronic spectra of barbaloin in the absence and in presence of CTDNA。

2.2; DNA对芦荟大黄素苷荧光发射光谱的影响 　　室温下，TrisHCl缓冲溶液中，当用260 nm波长激发，芦荟大黄素苷在360～440 nm之间有一个荧光发射峰，其荧光发射峰的最大位置在372 nm。当向溶液中加入小牛胸腺DNA后，芦荟大黄素苷的荧光发射峰明显增强，见图3。这可能是芦荟大黄素与DNA分子结合后，由于DNA双螺旋链具有疏水性作用，能够保护芦荟大黄素分子不受水分子的淬灭作用。