反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B 1 和B 2 的浓度

作者：李映章 张志宇 梁晟楠。

【关键词】 色谱法。

水溶性维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系，在人体的生命活动中具有十分重要的作用，它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。目前VitC，VitB 1 和VitB 2 传统测定方法中，VitC常用2，4—二硝基苯肼比色法和2，6—二氯靛酚钠盐滴定，这两个方法灵敏度较低，特异性差，目前一般科研项目都不采用这个滴定法;Vit B 1 和Vit B 2 可用荧光法，但该法前期处理操作繁冗，费时费力，其处理方法和过程增加了影响检测精确度欠佳的人为因素。本文数据采用液相色谱法分离检测。

1 实验部分 　　1.1 仪器 SY5000LIQUID CHROMATOGRAPII（BEIFN）具UV/VIS检测器，色谱柱:Lichrosphcr C18，4.6×250，5μm，TL9900色谱数据工作站。 　　1.2 试剂 本实验所用水为石英亚沸蒸馏水，以0.45μm水性微孔滤膜过滤。所用试剂均为分析纯（AR），甲醇为一级色谱纯，标样维生素C、B 1 、B 2 贮备液以0.01mol/L草酸配制，在4℃冰箱中保存。VitC临用新配。流动相A:0.05ml/L KH 2 PO4缓冲液（pH6.00）;流动相B:甲醇。均经0.45μm水性微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用。整个操作应避光，且操作过程要迅速，以防维生素被氧化。 　　1.3 样品处理 检测学生起床后将昨晚尿排空，空腹以200ml水送服VitC500mg，VitB 1 5mg和VitB 2 5mg，然后收集服药后4h内排出的尿于1000ml广口棕色瓶中，并加4%的草酸防护，尿液经0.45μm微孔过滤器过滤 ［4］ ，超声波脱气后即可上色谱柱分离检测。 　　1.4 色谱仪工作条件 色谱检测的流动相由磷酸二氢钾A和甲醇B组成，其比例为90∶10和65∶35。流速1.0ml/min，柱温:室温，波长:266nm，柱前压:168～240ATM。 　　1.5 标准曲线制作 配制一系列不同浓度的混合液，经检测得出的数据作出如下3种维生素的标准曲线（如图1示）。

1.6 色谱检测 分时间段采样，每采一批样有30个左右尿样。样品处理后，按标准样品检测的条件，以外标法检测VitC、VitB 1 和VitB 2 ，经TL9900色谱数据工作站处理检测出的数据和图形。

2 检测结果 　　经检测，得出样品中所含3种维生素的量，通过分析可得出如下结果（图2为一个样品的VitC、VitB 1 和VitB 2 3种维生素的色谱分析图）: 　　色谱法检测得此样品中VitC、VitB 1 和VitB 2 的峰高分别为1805mV、40mV和386mV，从标准曲线计算出其4h内排出尿样中的三种维生素的量分别为2.58mg、0.44mg和0.42mg。从五个斑151个尿样检测结果来看，VitC缺乏的占检测总数的15.23%，不足的占13.90%，正常的占70.87%;VitB 1 缺乏的占1.99%，不足的占3.31%，正常的占94.70%;VitB 2 不足的占16.56%，正常的占52.31%，良好的占31.13%（正常以上的占83.44%） ［1］ 。

3 讨论与总结 　　3.1 检测波长的选择 待检测的3种维生素中，VitC在261nm，VitB 1 在246nm，VitB 2 在260nm波长处有最大的吸收 ［2，3］ ，本次实验曾分别选用以上3种波长检测这三种维生素混合液，以上波长都不是这3种维生素混合液的最大吸收波长，经试验，最后确定266nm波长为三种待检测维生素的最佳检测波长。