大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究
作者：刘素君，郭红，潘明，杨志荣，张杰。
【摘要】 目的研究大蓟总黄酮对肿瘤细胞凋亡的影响。方法用不同浓度的大蓟总黄酮对人肝癌SMMC—7721和人子宫癌细胞Hela进行处理，MTT法检测细胞活性，再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA“梯子”(Ladder)和DAPI染色观察凋亡小体。结果大蓟总黄酮对SMMC—7721的半数致死量(IC50)为93.64 μg/ml；对Hela细胞的半数致死量(IC50)为85.1 2 μg/ml。可见清晰的“梯子”状DNA带纹和凋亡小体。结论大蓟总黄酮能诱导癌细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的作用。
大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium japonicum DC. 的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高100～150 cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5～6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦,归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。大蓟的主要成分为黄酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用［2］。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能［3］。但总黄酮对肿瘤细胞诱导凋亡的作用还没有研究，本文就其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用进行初步探索。
1 材料与仪器。
1.1 瘤株SMMC—7721和Hela细胞株，购自上海细胞生物学研究所。药物：大蓟由成都中药材公司提供。
1.2 试剂RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)为GIBCO公司产品，染料碘化丙啶(PI)、胰蛋白酶均为Sigma公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海普飞生物技术有限公司。
1.3 仪器酶标仪（Bio—Rad，Model 3550），离心机（北京医用离心机厂，LDZ5—2），倒置显微镜（Nikon DEAPHOT Fx—35DX）。
1.4 大蓟总黄酮的制备大蓟总黄酮由本室制备。将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分;流洗结束后倒出硅藻土化合物,挥干溶剂重新装入玻璃管柱,正丁醇流洗提取,用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后，在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控,提取至流洗液无黄酮反应时结束;将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂,用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱,依次用水和95%的乙醇洗脱,收集95%的乙醇洗脱液,洗脱至检测无黄酮反应时结束;浓缩95%的乙醇洗脱液,自然干燥,挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮为98.52%。总黄酮用DMSO溶解。
2 方法。
2.1 MTT法检测药物对肿瘤细胞增殖的作用SMMC—7721和Hela细胞株用0.25%胰蛋白酶化后，悬浮于含5%小牛血清的RPMI1640培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液。取少许细胞悬液于血细胞计数板计数，活细胞数大97%，将细胞株悬液接种于96孔培养板,每孔190 μl(含1 ×104个细胞),24 h后，分别加入阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照（5—Fu）以及12.5～200 μg /mg不同浓度的大蓟黄酮提取液各10 μl,3复孔，置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养72 h,然后每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液（用生理盐水配制）继续培养4 h，仔细吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl。1 h后，在570 nm波长处用酶标仪测OD值。重复3次并计算抑制率。抑制率(IC)=(对照组OD值—实验组OD值)/ 对照组OD值× 100%。
2.2 DAPI染色的染色体DNA的形态分别收集大蓟总黄酮处理细胞和未用药的细胞用定色剂（甲醇∶乙酸为3∶1）染色10 min，10 min后用PBS冲洗，细胞再用DAPI液（1 μg溶解在1ml PBS中），然后用固定液固定，染色体DNA的形态在荧光显微镜下观察。
2．3 DNA琼脂糖凝胶电泳分别收集大蓟总黄酮和顺铂处理细胞1×105 个，按酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀等常规方法提取细胞总DNA，2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察DNA条带。