大鼠大脑皮质神经元的原代培养
【摘要】 目的 探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。 方法 体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。 结果 用神经基础培养基(Neurobasal—A)+B27培养的神经元纯度可达85%,生长状态较佳。 结论 以Neurobasal—A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳,纯度较高,是体外研究神经系统相关理论的良好模型。
【关键词】 大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物； 细胞，培养的。
ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats. Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons. Results The primary cortical neurons cultured with neurobasal—A/B27 grew quite well and the purity was about 85%. Conclusion The primary cortical neurons cultured with neurobasal—A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.
KEY WORDS: cerebral cortex; neurous; disease models,animal; cells,cultured; nuride。
中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤,为研究其具体的作用机理及防治措施,建立合适的体内外模型至关重要。神经元原代培养是研究神经元形态结构及缺氧、缺血、中毒、外伤等病理因素影响的重要方法之一,为进一步的研究提供良好的原代神经元生物学材料,笔者探讨大鼠大脑皮质神经元的原代培养方法。
1 材料与方法。
1.1 试剂和动物。
神经基础培养基(Neurobasal—A)、胎牛血清(FBS)、B27(美国Gibco公司),左旋多聚赖氨酸(PLL,美国Sigma公司),DF—12(美国Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Amerisco公司),NSE(Neuron—Specific enolase,神经元特异性烯醇化酶)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),UltraVision二抗试剂盒(美国Neomarker公司),其他试剂为国产分析纯。新生健康SD大鼠(24 h)［福建医科大学实验动物中心,许可证号SCXK(闽)2004—002］。
1.2 皮质神经元原代培养 培养方法按参考文献［1—3］改进后进行。大鼠3只,75% 冷乙醇浸泡3~5 min,无菌条件下断头杀死,取出大脑,放入预冷的D—PBS平衡盐液中。在解剖镜下仔细分离去除脑膜及血管,分离出大脑皮质并剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm大小。组织块以0.25% 胰蛋白酶消化,并用含10%FBS的DF12完全培养基制成单细胞悬液,以1×106mL—1密度接种在经PLL处理过的培养瓶,于37 ℃、相对体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。细胞培养4 h后,将种植液(含10% FBS的DF12)全量换成含2%B27的Neurobasal—A培养基维持培养,以后每隔3 d以Neurobasal—A/B27半量换液。培养瓶包被方法:用0.01 mg/mL的PLL 37 ℃包被1 h,PBS洗2遍,直接接种。
1.3 形态学观察。
将培养不同时间的神经元于LEITZ倒置显微镜下进行观察,注意神经元的生长状况。
1.4 免疫细胞化学鉴定。
神经元培养4 d,弃去培养液;冷4％多聚甲醛固定20 min;3％H2O2阻断内源性过氧化物酶;封闭后滴加一抗NSE多克隆抗体(1∶200),4 ℃过夜;加二抗(生物素标记羊抗免IgG),室温孵育30 min;DAB显色;中性树胶封固,镜下观察。阴性对照实验用0.01 mol/L PBS代替一抗,其余步骤同上。镜下随机选取30个视野,计数NSE阳性神经元的百分率。
1.5 电子显微镜观察。
用玻璃瓶常规培养细胞至4 d时,以胰蛋白酶消化分离并收集细胞,迅速投入3 %戊二醛＋1.5 %多聚甲醛混合电镜固定液中,经1 %锇酸后固定,梯度酒精脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,透射电镜下观察,注意神经元的超微结构。
2 结 果。
2.1 细胞形态学变化。
培养4 h细胞基本贴壁,呈圆形透亮,体积小,立体感强,偶见少数细胞伸出细小短突起。培养1 d,大部分细胞长出突起,长度约为胞体直径的1~2倍,偶见相邻突起相连接;胞体圆形或椭圆形,饱满,光晕明显(图1A)。培养2 d,细胞数目增多,突起增长(图1B)。培养3 d,胞体明显增大,呈圆形、椭圆形或锥体形,表面光滑,折光性强;突起明显增长,较多突起相连接(图1C)。培养4 d后,突起进一步增多、增长。培养6 d时,神经元胞体开始聚集,突起相连呈网络样生长(图1D)。培养7 d,胞体聚集更明显。随着培养时间的延长,神经元突起纵横交错,难以辨认突起的起源(图1E)。
2.2 神经元的免疫组织化学鉴定。
取不同培养时间的细胞行NSE免疫组化染色发现:培养4 d以前的细胞含有较多的非神经元细胞,神经元阳性率低;培养5 d以后的细胞神经元阳性率增高,但其胞体开始聚集,甚至突起互相交错、难以辨认突起的起源,染色阳性的神经元形态不典型。取培养4 d的细胞进行染色,发现神经元的形态比较典型,阳性率也较高,其结果显示:NSE阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色,细胞核淡染,神经元胞体呈圆形、椭圆形或锥体形等,有较长的突起伸出,突起为单极、双极或多极(图2)。阴性细胞的细胞质和突起未呈棕色或棕褐色。计算NSE阳性细胞百分率,神经元数目可达85%以上。