正交实验法优化紫茎泽兰总黄酮提取的技术创新
紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng）菊科泽兰属植物，因其茎、叶柄呈紫色，故名紫茎泽兰[1]，是我国危害最为严重的外来入侵物种之一[2]。紫茎泽兰化学成分分析文献显示，其含倍半萜、甾体、三萜、黄酮、苯丙素酚等类型化合物[3—4]。近年来，黄酮类化合物因其在保护心血管、抗氧化自由基等方面的功效而受到关注。摸索紫茎泽兰中黄酮的提取工艺，利用紫茎泽兰提取黄酮，原材料经济、易得，亦为紫茎泽兰的防治开辟一条新的途径。杨郭等[5]研究了紫茎泽兰总黄酮的提取工艺，但没有把影响得率的重要因素之一提取次数纳入工艺提取设计之中，本研究将乙醇浓度、提取温度、液料比、提取时间、提取次数作为考察因素优化紫茎泽兰总黄酮提取工艺。 1仪器、试剂与材料 11主要仪器、试剂 721型分光光度计（四川分析仪器厂）、超声波器、旋转蒸发仪、数显恒温水浴锅HH—2型（国华电器有限公司）、远红外恒温干燥箱、赛特路斯电子分析天平BS210S型、XA—1型高速万能粉碎机（银河实验仪器厂）。 芦丁标准品；乙醇（分析纯，重庆化学试剂总厂）；10%硝酸铝（分析纯，天津市化学试剂三厂）；5%亚硝酸钠（化学纯，北京化工厂）；1mol/L氢氧化钠（分析纯，天津致远化学试剂公司）。 思想汇报 /sixianghuibao/ 12材料 紫茎泽兰总黄酮含量在发育过程中呈不断上升趋势，其在夏季生长旺盛，夏秋之交黄酮含量较高。在九月份采集成熟、肥厚的紫茎泽兰叶片（采至昆明市西南林业大学校园林地）风干备用。在使用前将风干的材料置于恒温干燥箱中，至60℃烘干，捣碎。 2方法 采用乙醇浸提法提取紫茎泽兰中黄酮化合物，以芦丁为标准品，制作浓度吸光度标准曲线，可见紫外分光光度计法测定提取液的吸光度，从而计算黄酮得率。通过单因素试验和正交试验，对影响黄酮得率的主要因素进行筛选，从而得到紫茎泽兰中总黄酮的最佳提取工艺。在测定样品吸光度时，加入亚硝酸钠，防止黄酮类化合物被氧化；加入硝酸铝，形成黄酮铝络合物，增强其吸光度；最后，加入氢氧化钠，使其吸收峰红移，利于排除其他物质的干扰。 21标准曲线的制作 211标准曲线制作方法 精密称取芦丁对照品0125g，将其溶解于适量乙醇中，用乙醇定容至100ml，摇匀，精密吸取10ml置25ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得每1ml中含无水芦丁05mg溶液。精密量取对照品溶液1、2、3、4、5ml，分别置于25ml容量瓶中，各加水至5ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟；加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟；加1mol/L氢氧化钾10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。分光光度法，在510nm波长处测定其吸光度。并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
思想汇报 /sixianghuibao/ 212标准曲线及其方程 按上述方法操作，测得不同浓度下的吸光度A值，结果见表1。并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出AC标准曲线，见图1。 表1标准曲线结果统计表 对照品溶液 体积（ml）012345芦丁（mg/ml）00000200400600801吸光度0000004100800123016402 图1标准曲线 芦丁浓度（mg/ml）、芦丁标准液浓度（X）与吸光度（Y） 作线性回归，得到标准曲线的回归方程为Y=201X+0001；R2=09995。从该标准曲线方程及其相关系数可以看出，该标准曲线的线性关系良好。 22紫茎泽兰中黄酮类化合物得率的测定 将1g紫茎泽兰的乙醇浸提液烘干，定容至10ml，再取1ml，分别加入亚硝酸钠、硝酸铝以及氢氧化钠溶液，定容后测其吸光值，计算其黄酮类化合物的得率。其计算公式为E=（Y—0001）/201。式中，Y为测得的吸光度。 23正交设计实验因素选择 根据文献报道，影响紫茎泽兰得率的因素很多，影响较大的有提取时间、液料比和提取次数， 影响较小的有提取温度、提取浓度。因此，对提取温度和提取浓度作单因素试验，对提取时间、液料比和提取次数做多因素试验。 3结果与分析 31实验温度对得率影响的试验 称取10000+00005g紫茎泽兰干叶子，分别在60、70、80、90℃的水浴锅中进行回流，时间为05h，液料比为1∶20，次数为1次，趁热过滤。吸取滤液1ml，测定吸光度Y值。结果见下表： 表2提取温度对黄酮得率影响结果统计表 温度（℃）吸光度平均值料重600118011901000160012009998700120012251000470012510002800112012100999880013010002900120011550999990011110000从上图表可以看出，随着温度的升高，黄酮得率随之升高，在70℃时达到最大值。如果温度过高，会出现其它杂质溶出增多、溶剂消耗过大等负面影响。 32乙醇浓度对得率影响的试验 称取10000+00005g紫茎泽兰叶，分别用60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇，在70℃下提取05小时，趁热过滤。吸取滤液1ml，测定吸光度Y值。 表3乙醇浓度对黄酮得率影响结果统计表 乙醇浓度（%）重量（g）〖〗吸光度601000301226510005013070100010211750999801548009997013685100030122从表3可以看出，随着乙醇浓度的增加，吸光度也随之增加，当乙醇浓度在70%时，吸光度最高，之后，吸光度随乙醇浓度的增高而降低。 代写论文 33正交试验 以提取时间、提取次数和液料比为考察因素，以黄酮类化合物的得率为考察指标，选用L9（34）进行正交试验，以考察提取得最佳工艺。各考察因素及其水平见表4。 表4正交试验因素及其水平 水平液料比（ml/g）时间（h）次数15∶115120∶12225∶1253根据上表中的各条件提取，取提取液1ml，测定其吸光度Y，结果见表5： 表5正交试验设计及结果统计表 液料比 （ml/g）时间 （h）次数吸光度得率 （%）115∶11510125062215∶1220123061315∶12530145071420∶11520111055520∶1230145071620∶12510133066725∶11530130064825∶1210131064925∶12520147073均值1013101220130＼＼均值2013001330127＼＼均值3013601420140＼＼极差000600200013＼＼4结论 各考察因素对黄酮得率的影响程度不同，按其影响。