人心房利钠肽对机械通气肺损伤大鼠肺组织的药学价值分析

在急性肺损伤或者呼吸衰竭等危重症的救治中，机械通气是影响患者预后的重要措施，但笔者发现它本身可诱发或加重肺损伤，即机械通气所致肺损伤（VILI）[1—2]。人心房利钠肽（ANP）一种活性多肽，具有利钠、利尿、扩张血管、调节体液平衡、抑制炎性介质释放等多种作用[2]。本研究拟观察机械通气损伤大鼠肺组织NF—B、肺水含量及相关细胞因子表达的改变，探讨ANP对VILI的治疗作用及其机制。 　　1 材料与方法 　　1.1试剂 　　人心房利钠肽（批号：S21535—312，Sigma公司，德国）；大鼠TNF—及IL—l ELISA检测试剂盒（ADL公司，美国）；核蛋白抽提试验盒（上海迪奥生物科技有限公司，中国）；NF—B P65多克隆抗体（Santa Cruze公司，美国）。 　　1.2 动物分组与模型制备 　　湖北医药学院实验动物中心提供Wistar大鼠30只，随机分为三组：空白对照组（TV组，潮气量8 mL/kg）、机械通气肺损伤组（HV组，潮气量40 mL/kg）、人心房利钠肽组（HV+hANP组）。HV+hANP组于高容量机械通气30 min后静脉注射hANP[0.1 g/（kgmin）]，TV组和HV组于相同时间静脉注射等体积生理盐水。

毕业论文 　　模型制备：由左股静脉穿刺置管建立通道，进行输液，给药，并经此通道间断注射肌松药阿曲库铵维持大鼠肌肉松弛。常规消毒后，颈部正中切开气管，将气管导管经此插入，连接小动物呼吸机（HX—300，成都泰盟科技有限公司），行机械辅助通气，吸入气体为空气，呼吸频率设置为40 次/min，吸呼比为1∶1。机械通气4 h时静脉注射氯化钾处死大鼠。 　　1.3 标本采集及检测 　　1.3.1 肺组织核蛋白提取及定量 取右下肺叶肺组织约100 mg，充分洗涤，按照试剂盒说明，在组织样本中加入蛋白抽提试剂A—MIX，置玻璃均浆器冰上匀浆30～50次，时间约为2 min。将匀浆液转移至冷的离心管中，4℃于3000 r/min离心提供代写论文和论文代写服务]0 min，弃去沉淀，收集上清。将匀浆上清液转移到离心管中，加入蛋白抽提试剂A—1，于漩涡混合器中震荡20 s，于4℃保持10 min， 3000 r/min 4℃离心10 min，弃上清。取蛋白抽提试剂B—MIX 100 L加入离心管中，于漩涡混合器中震荡20 s，于4℃保持30 min，14 000 r/min于4℃离心2 min，上清转至新管中，为核蛋白。采用Bradford比色法测定核蛋白浓度，调节为0.5～1.0 g/L，放置—70℃冷冻保存。 开题报告 /html/lunwenzhidao/kaitibaogao/ 　　1.3.2 免疫蛋白印迹法（Western blot）测定NF—B P65的表达 严格按照Western blot步骤及要求操作。蛋白定量后，各组分别取20 g总蛋白，经10% SDS—PAGE分离、转膜和脱脂奶粉4℃封闭过夜，一抗为NF—B P65多克隆抗体，孵育过夜，洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5000稀释），常温孵育1 h，采用化学发光法进行显色，以GAPDH为内参照，用HPIAS2000型图像分析软件（北京航天航空大学）进行图像分析，检测其蛋白条带光密度值。 　　1.3.3 细胞因子的测定 采用双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测，试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，操作步骤严格按说明书进行。 　　1.3.4 肺组织湿/干重比（W/D） 将左肺下叶组织用滤纸吸干水分，在分析天平上精确称湿重（W）后放入80℃烤箱，烘烤48 h后称干重（D），计算肺组织W/D。 　　1.4 统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD—t检验，以P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 毕业论文 　　2.1 大鼠机械通气肺损伤模型的建立 　　大鼠高气道压机械通气后，心率增快，血氧饱和度下降，严重者在实验中途死亡。病理学检查发现肺损伤明显，有明显的炎症细胞聚集，部分肺泡腔出血、广泛渗出。见图1。　图1 肺损伤模型HE染色（200） 　　2.2 三组肺组织NF—B P65、TNF—、IL—l水平及肺组织W/D比较 　　与TV组相比，HV、HV+hANP组肺组织TNF—、IL—l含量明显上升，NF—B P65表达明显增加，肺组织W/D升高（P 0.05）；与HV组比较，HV+hANP组肺组织TNF—、IL—l含量明显降低，NF—B P65表达明显抑制，肺组织W/D明显降低（P 0.05），见表l、图2。 　　表1 三组肺组织NF—B P65、TNF—、IL—l水平 　　及肺组织W/D比较（xs） 　　注：与TV组比较，*P 0.05；与HV组比较，△P 0.05；TV组：空白对照组；HV组：机械通气肺损伤组；HV+hANP组：人心房利钠肽组；W/D：湿/干重比；TNF—：肿瘤坏死因子—；IL—l：白细胞介素— l 　　图2 各组大鼠肺组织NF—B P65蛋白表达情况 　　3 讨论 　　从本质上说，气压伤实际上是容积伤，本研究通过高气道压通气成功复制VILI模型[4]。结果表明，与TV组相比，HV组肺组织TNF—、IL—l含量上升，W/D比值升高，病理学检查肺损伤明显，有明显的炎症细胞聚集，部分肺泡腔出血、广泛渗出。表明肺通透性增加，病理损伤加重，提示大鼠机械通气肺损伤模型制备成功。 　　VILI的临床表现多样，主要包括气压伤、肺水肿等，其发病机制错综复杂[5]。本研究中HV组肺组织W/D比值升高，病理学检查肺间质水肿明显，表明肺水含量明显增加，提示肺水肿是导致机械通气肺损伤的主要因素[6—7]。同时，本实验亦发现HV组TNF—、IL—l含量上升，病理学检查炎症细胞聚集，表明促炎因子过度激活，细胞因子失衡，是VILI发生、发展的重要因素。分析其原因可能为机械通气吸气相引起肺泡扩张，导致较大的牵拉肺提供代写论文和论文代写服务]泡毛细血管的纵向张力，使毛细血管内皮细胞及上皮细胞损伤，通透性增加，富含蛋白的血浆成分漏出，导致肺水肿。血浆成分的漏出可诱发炎性反应，进而从上游水平激发炎症瀑布，TNF—等前炎症因子与肺血管内皮细胞相互作用，从而引起炎性反应放大和黏附分子的增加[8]。NF—B P65是诱导许多基因表达的重要调节因子。本研究NF—B P65表达的增加，说明它被TNF—、IL—l等炎性细胞因子激活，而与p38MAPK共同组成释放因子的 作文 /zuowen/。