高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸的含量
作者：刘磊 何再安 余子川 刘超英 刘焱文。
【摘要】 目的建立金银花提取物中绿原酸含量的HPLC测定方法。方法国产C18柱（4.6 mm×250 mm,7 μm）;流动相为乙腈：0.4%磷酸（12∶88）；检测波长为327 nm；流速1 ml·min—1；进样量10 μl；柱温25℃。结果绿原酸在0.071 6～0.644 4 μg范围内线性关系良好，r=0.999 6；平均回收率99.99%，RSD=1.61%（n=6）。结论该方法简便、快速、准确，可用于金银花提取物的含量测定及质量控制。
AbstractObjectiveTo establish a method for the determination of Chlorogenic acid in the extract of Flos Lonicerae.MethodsThe chromatographic conditions were as follows: C18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm,7 μm)，a mobile phase of acetonitrile and 0.4% H3PO4(12:88)，the detection wavelength at 327 nm and the flow rate being 1 ml·min—1. ResultsA linearity of Chlorogenic acid in the extract was obtained in the range of 0.071 6～0.644 4 μg r=0.999 6(n=6).The average recovery was 99.99% and RSD=1.61%(n=6). ConclusionThis method is easy, sensitive and accurate for the determination of Chlorogenic acid in the extract of Flos Lonicerae.
Key wordsChlorogenic acid; HPLC; Determination。
金银花Flos Lonicerae又名忍冬、双花 ，为临床常用中药 ,具有清热解毒、凉散风热之功效 ，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等［1］。在中成药中，金银花或以细粉直接入药，或以提取物的形式入药，但大部分制剂以后者的形式入药，但即使以后者入药，也有两种形式，一是以全草直接投料,煎煮入药，即以煎煮液(即药材的提取液)作为半成品(中间体)；另一种是先提取有效部位，而后以提取物投料，即以提取物作为中间体(原料)（刘艳娥《第二军医大学硕士学位论文》）。为了有效控制金银花提取物（中间体）的内在质量，本实验参考了有关文献［2，3］及2005版《中国药典》［4］方法，采用高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸含量。
1 仪器与试药。
Agilent 1100 series 高效液相色谱仪（G1322A排气阀，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器），chemistation 色谱工作站，Kromasil C18色谱柱，超声提取器（KQ3200DE型数控超声仪昆山市超声仪器有限公司）；绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号110753—200212)，金银花提取物（本实验室自制）， 乙腈，磷酸均为分析纯；水为双蒸水。
2 方法与结果［5］。
2.1 分析方法的建立——分离及检测条件的选择。
2.1.1 色谱条件 色谱柱为国产Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，7 μm）； 柱温25℃; 流动相为乙腈—0.4% 磷酸(12∶88)；流速为1 ml·min—1；检测波长327 nm。
2.1.2 pH值对峰形的影响 绿原酸属于有机酸类物质，在HPLC测定时易发生前沿或拖尾峰，流动相加入酸可以改善这种现象。本实验比较了水、乙酸、磷酸对峰形的影响，当选用0.4%磷酸时，可得到较好的色谱峰形。
2.1.3 色谱系统适应性实验 在选定条件下，绿原酸和样品中其他组分可基线分离，绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数（N）为5 000以上。结果见图1。
a—对照品 b—供试品。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液，即得。2.3 供试品溶液的制备 精密称取本提取物10 mg，置100 ml容量瓶中，双蒸水溶解，超声2 min后，再用双蒸水定容至刻度，摇匀，过0.45 μg微孔滤膜，取续滤液即得。