RPHPLC法测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量
【摘要】; 目的 采用反相高效液相色谱法建立了测定脑得生片中羟基红花黄色素A含量的方法。方法 采用超声波法提取，经大孔树脂HP20纯化后，以反相高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A的含量。色谱柱为Phenomenex Luna C18（5 μm，3.9 mm×150 mm），流动相为甲醇乙腈0.7%磷酸溶液(体积比21∶5∶74)，流速1 .0 mL·min—1，柱温30 ℃，检测波长403 nm。结果 羟基红花黄色素A在1.22～9.15 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9998。平均加样回收率为100.93%，RSD为1.73%。结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量。
【关键词】; 脑得生片 羟基红花黄色素A 含量测定 大孔树脂。
脑得生片由三七、川芎、红花、葛根和山楂等组成，具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效［1］。2005年版《中国药典》仅以三七皂苷为定量指标对脑得生片进行质量控制［1］。而红花作为该药的重要组成部分之一，其主要有效成分羟基红花黄色素A (hydroxyl safflor yellow A, HSYA)具有扩张冠状动脉、缓解心肌缺血和抗凝血、抑制血栓形成等作用［2, 3］，在脑得生片治疗脑血管疾病方面起重要作用。目前，关于脑得生片中红花成分的质量控制方法研究尚未见报道。本文建立了测定脑得生片中HSYA含量的RPHPLC法，为进一步有效控制脑得生片的质量提供了实验依据。
1; 仪器与试药。
1．1; 仪器 ; Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2996二极管阵列检测器；Waters Empower色谱工作站；KQ100超声波清洗器(100 W，昆山市超声仪器有限公司)；RE52CS旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1．2; 试药 ; 甲醇和乙腈为色谱纯，屈臣氏双蒸水，其他试剂均分析纯； HP20型大孔树脂（Diaion，日本三菱化学公司）；羟基红花黄色素A（批号：111637—200502; 中国药品生物制品检定所）；脑得生片（规格：3 g/片，批号分别为：20070302、20070312、20070322，广东药学院中药学院）。
2; 方法与结果。
2．1; 色谱条件与系统适用性试验 ; Phenomenex Luna C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)色谱柱；流动相为甲醇乙腈0.7%磷酸(体积比21∶5∶74)；检测波长为403 nm；流速为1.0 mL·min—1；柱温为30 ℃。理论塔板数以羟基红花黄色素A计算不低于3 000；分离度大于1.5；重复性RSD为1.58%；羟基红花黄色素A峰的拖尾因子为1.03。色谱图见图1。
图1; 羟基红花黄色素A对照品（A），阴性对照（B），供试样品(C)色谱图（略）。
Fig.1; HPLC chromatograms of reference substance(A),; negative reference substance HSYA (B) and sample（C）。
2.2; 溶液的制备。
2．2.1; 对照品溶液的配制 ; 取羟基红花黄色素A对照品1.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入30%（体积分数）甲醇5 mL，超声溶解后，用30%（体积分数）甲醇定容至刻度。精密移取5.0 mL，加30%（体积分数）甲醇稀释至10.0 mL，揺匀，制得质量浓度为0.061 mg·mL—1的对照品溶液，密封保存，备用。
2．2.2; 供试品溶液的制备 ; 取脑得生片20片，去糖衣，研细。取1.0 g，精密称定置具塞锥形瓶中，加入30%（体积分数）乙醇50 mL，超声提取30 min，滤过，滤液于50 ℃下减压回收至无醇味，然后加纯净水20 mL分散，水分散液过HP20型大孔树脂柱(内径1.5 cm，长10 cm)，以50 mL水洗脱，弃去水液。再用30%（体积分数）乙醇洗脱，收集50 mL，旋蒸仪浓缩至干，加30%（体积分数）甲醇溶解转移至25 mL容量瓶中，用30%（体积分数）甲醇定容至刻度，揺匀，即得。
2.2.3; 阴性对照溶液的制备 ; 按脑得生片处方比例制成不含红花的阴性对照样品，依“2.2.2”项方法制得阴性对照溶液。