IL27基因转染对小鼠结肠腺癌细胞生物学特性的影响

作者：杨丽娟, 胡洁, 白利锐, 吴丽娜, 魏林。

【摘要】 　　目的: 获得稳定表达小鼠IL27(mIL27)基因的小鼠结肠腺癌细胞株(Colon26), 研究IL27基因对小鼠结肠腺癌细胞体内外生物学特性的影响。方法: 通过脂质体法将pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒转染结肠腺癌细胞, 筛选建立高表达细胞株。采用Western blot、 ELISA、 RTPCR法证实IL27基因成功转染Colon26。用MTT比色法检测IL27质粒转染后对Colon26细胞生长的影响; 流式细胞术检测IL27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响; 将Colon26IL27细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下, 观察其致瘤性。结果: Colon26IL27细胞可表达IL27mRNA并分泌IL27, IL27的表达在体外对Colon26细胞的增殖、 凋亡均无影响, 而在体内则具有明显的抗瘤活性。结论: 成功制备Colon26IL27细胞株, 证明IL27能在体内明显抑制肿瘤的生长, 延长荷瘤小鼠的生存期, 具有一定的抗肿瘤作用。

【关键词】 白细胞介素27; 基因转染; 结肠癌。

白细胞介素27（Interleukin 27, IL27）是2002年发现并命名的IL6/IL12家族成员, 由p28和EBI3两个亚基组成, 可作用于固有性免疫和适应性免疫系统的多种免疫细胞而发挥广泛的免疫调节作用。它在Th0向Th1分化的早期调节中起重要作用, 可促进Th1型细胞应答, 从而增强细胞免疫应答［1］。已知机体免疫系统的抗肿瘤效应机制以细胞免疫为主, 因此细胞因子IL27在增强抗肿瘤免疫为策略的生物治疗上应有重要的应用前景。本研究中我们将IL27(mIL27)基因转染小鼠结肠腺癌细胞(Colon26), 并对转染后肿瘤细胞的生物学特征及致瘤性进行了观察, 为进一步深入研究IL27的抗肿瘤作用奠定基础。

1 材料和方法。

1.1 材料 pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒由本实验室制备保存; 脂质体Lipofectamine2000、 G418为Sigma公司产品; TRIzol RNA提取试剂盒为GENERAY公司产品; 小鼠IL27基因和βactin引物均为上海生物工程公司合成。BALB/c小鼠（4周龄, 雌性）由河北医科大学实验动物中心提供。Colon26细胞为本实验室保存。

1.2 方法。

1.2.1 IL27质粒脂质体法转染Colon26细胞 大量抽提pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒和pcDNA3.1HisB空质粒, 保存备用。转染前24 h用胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26细胞, 用无双抗、 无血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×109/L, 接种于24孔板, 每孔0.5 mL, 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。当细胞铺满孔底90%～95%时进行转染, 转染步骤参见说明书。转染Colon26细胞48 h后培养基中加入G418（200 mg/L）, 直至对照孔中的Colon26细胞完全死亡, 更换G418浓度（100 mg/L）继续筛选至细胞克隆形成, 挑取阳性克隆稀释扩增, 最终获得转入pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27或pcDNA3.1HisB的Colon26IL27细胞和Colon26HisB细胞。

1.2.2 Western blot检测IL27蛋白表达 胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞, 裂解细胞, 离心取上清, 分别加入1×SDSPAGE 缓冲液, 煮沸10 min, 在125 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳; 电转移法将蛋白转移至硝酸纤维膜上, 50 g/L脱脂奶粉封闭后相继与抗小鼠HisB单克隆抗体（mAb）和兔抗小鼠的IgG碱性磷酸酶标记二抗反应, BCIP/NBT底物显色。

1.2.3 ELISA法检测IL27蛋白表达 胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞, 裂解细胞, 离心取上清, 用包被液稀释后加入96孔板, 4℃包被过夜, 再用50 g/L脱脂奶粉37℃封闭1 h, 相继与抗小鼠HisB mAb和兔抗小鼠的IgG酶标记二抗各反应1 h, 底物显色30 min后测A450值。

1.2.4 RTPCR检测IL27的mRNA表达 自IL27中间段设计2条引物以检测IL27的mRNA表达, 检测产物长度860 bp, 上、 下游引物分别为: 5′TGTTGCTGCTACCCTTGCTTCTGG3′; 5′AAGGACGTGGATCTGGTGGAGTTG3′。βactin（619 bp）上、 下游引物分别为: 5′AAGAGAGGCATCCTCACCCT3′; 5′GGAAGGAAGGCTGGAAG3′。胰酶消化分别收集Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞, 调细胞密度5×109/L, 按照TRIzol 总RNA 提取法提取细胞总RNA, 逆转录合成cDNA, 进行PCR扩增: PCR反应参数为: 94℃预变性 5 min; 94℃ 30 s, 57℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共30个循环; 72℃延伸 7 min。取 PCR反应产物10 μL, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。