NO和iNOS在大鼠糖尿病早期肾脏中的变化

【摘要】 目的：观察糖尿病大鼠早期肾脏中一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase ，iNOS）活性变化，探讨NO/iNOS 在糖尿病早期肾脏损害中的作用机制。方法：取成年健康SD大鼠60只，随机分成糖尿病组（DM组）和正常对照组（NC组）,每组30只。DM组大鼠采用一次性腹腔内注射STZ制造糖尿病大鼠模型，成模后和NC组分别于第1、2、4周麻醉取左肾，用硝酸还原酶法和吸光光度法测定肾组织中NO含量、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和iNOS活性。所有数据用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。结果：① DM组大鼠肾组织中NO含量、NOS和iNOS活性分别较同批NC组有显著性差异（P0.05）；②各组大鼠中NO含量与NOS活性、iNOS活性呈正相关。结论：糖尿病大鼠早期肾脏中iNOS活性增强，催化生成的NO在糖尿病早期肾脏损害中发挥重要作用。

【关键词】 诱导型一氧化氮合酶； 糖尿病； 一氧化氮； 一氧化氮合酶。

细胞信号传递系统NOSNO在糖尿病肾损害的发病机制中起重要作用。NOS是 NO合成的限速酶，是调节 NO的最重要环节。目前已经证实肾脏中 NOS有三种亚型，神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）、诱导型（iNOS）。nNOS和iNOS分布于胞浆，eNOS存在于细胞膜。iNOS作为NOS三种亚型中最特殊的一种亚型近些年来成为许多研究者热衷的课题，它的活性不依赖于Ca/CaM（钙/钙调蛋白），而需要诱导因子如内毒素、γ干扰素、白介素1等存在。所以，iNOS仅在受到免疫或细胞因子刺激时才被激活，引起NO长期大量释放，参与病理生理过程。目前在糖尿病肾病中iNOS变化倍受关注，许多学者对糖尿病肾脏中的iNOS进行了研究，但结论存在较大的争议，尚无统一定论。本实验通过建立大鼠糖尿病模型，用硝酸还原酶法和吸光光度法，动态观察大鼠糖尿病早期肾脏中NO含量和iNOS活性变化，探讨NO和iNOS在糖尿病早期肾损害中作用机制。

1 实验材料。

11 主要试剂链脲佐菌素（STZ）购于美国Sigma公司；NO测试盒（A012） 、NOS组织试剂盒和iNOS组织试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯。

12 主要仪器TGLL18G台式高速冷冻离心机 （江苏泰昌公司）；UV751GD紫外/可见分光光度计 （上海）；DY89Ⅰ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝科器研究所）；SHZ88 水浴恒温振荡器（江苏金坛）。

13 实验动物成年健康SD大鼠60只，雌雄不限，体重200～220g（由辽宁医学院实验动物中心提供）。

2 方法。

21 动物模型的建立取上述SD大鼠60只，随机分成正常对照组（NC组）和糖尿病组（DM组），每组30只。标准颗粒饲料喂养，不限食水。室内通风良好，相对湿度40%～70%，室温18℃～22℃。DM组大鼠按50mg/kg 体重一次性腹腔注射STZ溶液，同时，NC组一次性腹腔注射等体积生理盐水，连续监测鼠尾血糖3d，持续血糖浓度13.8mmol/L者，确定为糖尿病模型。此后定期监测鼠尾血糖。

22 肾组织匀浆制备DM组大鼠成模后，与NC组大鼠分别于成模后第l、2、4周取右肾，沿横轴切割组织块约0.2g～1g，入冰生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸滤干，称重后放入5ml烧杯内。用移液管取总量生理盐水（生理盐水体积总量应该是组织块重量的9倍）于烧杯中，用眼科小剪剪碎组织块（烧杯放入冰水中进行）。用组织捣碎机10000~15000rpm上下研磨制成10%肾组织匀浆（匀浆时间每次10s，间隙30s，连续3～5次，在冰水中进行）。

23 肾组织NO含量、NOS和iNOS活性测定。

231 肾组织蛋白含量测定 将上述10%肾组织匀浆静置30min，冷冻离心机（3000rpm）离心10min，留取上清液。按照蛋白含量测定说明书加入试剂，利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取595nm，1cm光径）测量各样本吸光度值（OD值1），代入以下公式，计算出肾组织蛋白含量。蛋白含量（g/L）＝测量管OD值1 标准管OD值1× 标准管浓度（g/L）。

232 肾组织NO含量测定 按照NO测试盒说明书加入试剂，再利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取550nm，0.5cm光径）测量各样本吸光度值（OD值2），与测得的各样本蛋白含量代入以下公式，计算出肾组织NO含量。 NO含量（μmol/gprot）=　测量管OD值2—空白管OD值2 标准管OD值2—空白管OD值2×标准品浓度(20μmol/L)／样本的蛋白含量(gprot/L)。

233 肾组织NOS活性测定 按照NOS组织试剂盒说明书加入试剂，利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取530nm，1cm光径）测量各样本吸光度值（OD值3），与测得的各样本蛋白含量代入以下公式，计算出肾组织NOS活性。NOS活性（U/mgprot）=NOS测定管OD值3—空白管OD值3 呈色物纳摩尔消光系数×反应液总体积 取样量×1 比色光径×反应时间／蛋白含量(mgprot/L)。

234 肾组织iNOS活性测定 按照iNOS组织试剂盒说明书加入试剂，利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取530nm，1cm光径）测量各样本吸光度值（OD值4），与测得的各样本蛋白含量代入以下公式，计算出iNOS活性。iNOS活性（U/mgprot）=　iNOS测定管OD值4—空白管OD值4 呈色物纳摩尔消光系数×反应液总体积 取样量×1 比色光径×反应时间／蛋白含量(mgprot/L)以上3项生化指标具体操作均按说明书进行。

24 统计处理所有统计资料用均数±标准差（±s）表示。应用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析。统计方法：DM组与NC组大鼠之间采用配对t检验；DM组大鼠各病程之间采用单因素方差分析，并进行q检验；NO与iNOS活性、NOS活性间进行相关分析。所有资料在分析之前进行方差齐性检验。