新生鼠坏死性小肠结肠炎肠细胞凋亡率变化及意义
作者：董海英， 刘健， 陈兢芳， 卓玲， 杨燕珍， 吴斌。
【摘要】 目的 探讨新生鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)肠细胞凋亡率变化及其与肠组织损伤程度的关系。 方法 出生48 h的SD大鼠16只随机分成模型组和对照组，每组8只。模型组给予鼠乳代用品人工喂养，100%氮气缺氧90 s，4 ℃冷刺激10 min，每天2次，连续3 d，建立NEC模型；对照组与母鼠同笼，鼠乳喂养，未进行缺氧冷刺激。实验结束后24 h处死大鼠，留取十二指肠下端至直肠上端肠道组织进行肠组织损伤评分和肠细胞凋亡率检测。每组随机抽取2例回盲部近端小肠进行肠黏膜透射电镜检查。 结果 模型组肠组织学改变与NEC时改变一致，透射电镜显示肠黏膜出现大量凋亡细胞，部分形成凋亡小体。模型组和对照组肠组织损伤评分分别为（3.33±0.59）和（0.13±0.17）；肠细胞凋亡率分别为（31.0±10.6）%和（4.6±3.9）%；二者比较差别均有统计学意义。肠细胞凋亡率与肠组织损伤评分呈显著正相关(r=0.771，P0.01)。 结论 NEC时肠细胞凋亡明显增加。肠细胞凋亡可能是造成新生鼠NEC肠道进行性损伤的病理基础。
【关键词】 小肠结肠炎,伪膜性； 婴儿； 新生，疾病；疾病模型，动物； 细胞凋亡。
坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿时期严重的肠道炎症性疾病，是新生儿重症监护病房中最常见的外科急症。虽然大量研究证实NEC发病与早产、肠管缺氧缺血、肠内喂养、细菌感染等有关，但其确切发病机制仍不明确[12]。近年来研究证实，胃肠道屏障功能受损是胃肠功能障碍发生的病理基础，是多种严重疾病和器官损伤的共同病理生理过程；其中，胃肠上皮细胞结构的完整是维持其屏障功能的形态学基础，肠上皮细胞及细胞间相互连接紧密程度及其完整性决定肠黏膜屏障通透性[2]。本研究通过人工喂养、缺氧和冷刺激复制新生大鼠NEC模型，采用流式细胞仪检测肠细胞凋亡率，结合肠组织损伤评分、肠黏膜电镜观察，探讨新生大鼠NEC发病过程中肠细胞凋亡率变化及其与肠损伤的关系，为阐明NEC的发病机制、寻找直接有效的治疗药物提供实验依据。
1 材料与方法。
1.1 动物及分组 清洁级新生SD大鼠16只，出生48 h，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)20070005]。剔除每胎12只或每胎6只者。每窝5～6只，雌雄不限，体质量5～10 g。生后48 h随机分成模型组和对照组，每组各8只。模型组新生大鼠与母鼠分开，置入保育箱中，采用鼠乳代用品人工喂养，100%氮气缺氧90 s，4 ℃冷刺激10 min，每天2次，连续3 d，建立新生鼠NEC动物模型[3]；对照组继续与母鼠同笼，鼠乳喂养，未进行缺氧冷刺激。NEC模型组在造模结束后24 h和对照组新生鼠空腹断头处死，打开腹腔取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织。
1.2 主要试剂 雅培加营素蛋白质粉由美国雅培公司提供；低出生体质量婴儿配方奶粉由雀巢公司提供；中/长链脂肪乳注射液(C6～24)购自华瑞制药有限公司。胃蛋白酶(美国Sigma 公司)；Aanxin V/PI试剂盒(美国贝克曼公司)。根据实验要求，自制新生鼠保育箱，保育箱内环境温度、湿度用Hygro电子温湿度计24 h监测。
1.3 方法。
1.3.1 病理学检查 取回盲部近端肠管1 cm置于10%甲醛中固定，石蜡包埋，取冠状切面，HE染色后在光镜下观察肠组织形态学改变。采用双盲法进行肠组织损伤评分。参照文献[1，3]分为4级：0分为正常，1分为轻微黏膜下和或固有层分离，2分为中度黏膜下和/或固有层分离和/或黏膜下和肌肉层水肿，3分为严重黏膜下和/或固有层分离和/或黏膜下和肌肉层水肿、局部绒毛脱落，4分为肠绒毛消失伴肠坏死；组织学评分≥2分确定为NEC。每一例新生鼠回盲部肠组织标本观察3个视野，取其平均值。
1.3.2 凋亡率检测 除留取回盲部远端结肠1 cm用于常规病理检查及肠组织损伤评分外，将其余所有肠管(从十二指肠下端至直肠上端肠道组织)用于肠细胞凋亡检测。剖开肠管，棉签小心清除粪便，用冰生理盐水漂洗1～2遍，再用PBS液漂洗至肠管干净。剪成1 mm×1 mm×1 mm，置于300目金属网筛，用玻片轻搓至匀浆状，接着用PBS液将匀浆状的肠组织冲洗至烧杯中。网筛过滤2次后，将细胞悬液置于15 mL的离心管中1 000 r/min离心10 min，弃上清，剩1 mL细胞悬液，加入0.2%胃蛋白酶0.9 mL吹打2 min，加入生理盐水2 mL，1 000 r/min离心10 min，弃上清，剩余细胞悬液加入生理盐水至0.5 mL，将0.5 mL细胞悬液加入Anneix VFlous标记液室温孵育20 min后流式细胞仪(EPICS XL型，USA)检测，记数10 000个肠细胞检测凋亡细胞数。FCM凋亡图的读取：结果分为4个象限，分别表示活细胞、坏死细胞、凋亡细胞、受损细胞，经计算机处理，得到绝对数和百分率。
1.3.3 透射电镜检查 每组随机抽取2例回盲部近端小肠1 cm，剖开，冰生理盐水漂洗干净后，3%戊二醛1.5%多聚甲醛前固定数天(或数小时)(4 ℃)，1%锇酸1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h，PBS漂洗；70%酒精饱和醋酸铀染液块染，酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片80 nm，醋酸铀、柠檬酸铅各染色5 min；在日立Hu12A型或飞利浦EM 208型透射电镜下观察上皮细胞紧密连接、微绒毛改变，肠上皮细胞凋亡改变。
1.4 统计学处理 实验结果以x±s表示，采用SPSS 11.0统计学软件进行统计学分析。α=0.05为差别有统计学意义。
2 结果。
2.1 外观表现及生长情况 造模后，NEC模型组新生SD大鼠相继出现腹泻、腹胀、活动减少，外观消瘦，随缺氧冷刺激次数的增加，上述表现逐渐明显。对照组新生SD大鼠进食及排便均正常，无腹胀及胃潴留，活动度良好，皮下脂肪丰满。
2.2 病理改变 对照组回肠部结构完整，肠黏膜完好，上皮完整、连续、腺体排列规则，组织结构清楚、分泌功能活跃、固有层血管无扩张，肌层无异常，无炎性细胞浸润及溃疡(图1A)。NEC模型组回肠部肠黏膜和黏膜下层充血、水肿，固有层较多中性粒细胞浸润，少数可见黏膜上层脱落(图1B)；严重者出现绒毛脱落、坏死，绒毛结构消失，甚至肠穿孔；固有层多量淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润(图1C，D)。
A:对照组;B～D:模型组. A:肠结构正常,肠组织损伤评分0分;B:肠黏膜和黏膜下层轻度水肿,肠组织损伤评分2分;C:肠黏膜和黏膜下层水肿明显,局部绒毛脱落,肠组织损伤评分3分;D：肠黏膜和黏膜下层水肿明显,绒毛坏死脱落,结构消失,肠组织损伤评分4分. 图1 坏死性小肠结肠炎大鼠回盲部肠组织病理学改变(HE染色, ×200)（略）。
Fig 1 Histopathological changes in the intestine of NEC rats(HE staining, ×200)。
2.3 透射电镜观察 对照组新生大鼠肠黏膜上皮细胞形态完整，细胞核与细胞器清晰可见，细胞核呈圆形，核内染色质均匀，结构未见异常，表面微绒毛排列整齐；细胞紧密连接清楚，无增宽(图2A)。模型组新生大鼠肠黏膜出现大量的凋亡细胞，表现为细胞皱缩、变小，细胞质致密，细胞器相互靠近，核固缩，染色质浓缩，沿着核膜排列，形成不同形状和大小的块状，有些已形成了凋亡小体(图2B)；同时，微绒毛破坏严重，线粒体见水肿、嵴减少或消失，细胞间紧密连接破坏，细胞器发生浓缩(图2C，D)。
2.4 肠组织损伤评分及细胞凋亡检测 模型组和对照组肠组织损伤评分、肠细胞凋亡检测结果见表1；KruskalWallis H检验2组肠损伤组织评分、肠细胞凋亡率差别有统计学意义。以肠细胞凋亡率为一变量，肠组损伤评分为另一变量，进行非参数Spearman等级相关分析，结果显示，肠细胞凋亡率与肠组织损伤评分呈显著正相关关系（r=0.771，P0.01）。