抵抗素对3T3—L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响
作者：李芳萍， 李焱， 傅玉如， 严励， 傅祖植。
【摘要】 【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3—L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】 用RT—PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A/T克隆于pGEM—T载体，再亚克隆于pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（—）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）—resistin和 pcDNA3.1（—）—resistin（—）。将pcDNA3.1（—）—resistin（—）转染小鼠3T3—L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3—L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用3H—2—脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。 【结果】插入pcDNA3.1（+）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因 mRNA编码区序列完全一致，且方向正确； 插入pcDNA3.1（—）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3—L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P 0.05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3—L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。
抵抗素（resistin）是2001年发现的存在于血浆中富含半胱氨酸的分泌性蛋白质。在啮齿类动物其主要由脂肪细胞特异性分泌，可损害机体的糖耐量，影响组织对胰岛素的敏感性 [1]，被认为是一种将肥胖与2型糖尿病联系起来的重要信号分子[2]。已明确抵抗素基因及蛋白质的分子结构， 抵抗素基因表达受胰岛素[3]、肿瘤坏死因子α[4] 等多种因素调控， 抵抗素可能与肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病的关系密切[5]，可能直接影响血管内皮细胞功能，参与动脉粥样硬化的形成[6,7]。为开展抵抗素生物功能研究, 我们拟构建载有小鼠抵抗素基因及其反义核酸的真核表达质粒。 抵抗素基因反义核酸的真核表达质粒转染3T3—L1脂肪细胞，试图让抵抗素基因反义核酸抑制3T3—L1脂肪细胞抵抗素基因的表达，观察抵抗素对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。
1 材料与方法。
1.1 主要试剂。
pGEM—T Vector system I（Promega 公司），pcDNA3.1(+)和 pcDNA3.1(—)真核表达质粒（Invitrogen公司）。3T3—L1前体脂肪细胞（由北京医院老年研究所细胞室提供），SuperFect Transfection Reagent (QIAGEN公司),G418(购自GIBCO BRL公司）,Complete,Mini复方蛋白酶抑制药片（Roche公司）3—异丁基1—甲基黄嘌呤（Sigma公司），短效胰岛素（Humulin R，美国礼来公司），地塞米松（中国浙江医药股份有限公司），豚鼠抗小鼠抵抗素抗体（一抗，Guinea pig anti—mouse resistin，Linco公司），辣根过氧化物酶结合的抗豚鼠IgG（H+L）(晶美公司)，细胞松弛素B（Sigma公司） 3H—2—脱氧葡萄糖（放射性比活度200 GBq/mmol，中国同位素总公司）。
1.2 方法。
1.2.1 引物设计 根据文献报道的小鼠抵抗素 基因mRNA序列（基因库的登录号为AF323080），用计算机软件设计扩增抵抗素基因mRNA编码区序列的特异引物，上游引物：5′—CGGAATTC ATGAAGAACCTTTCATTTCC —3′（下划线的部分为Eco RⅠ酶切位点），下游引物：5′—CTAGTCTAGA TCAGGAAGCGACCTGCAGCT —3′（下划线的部分为XbaⅠ酶切位点）。上、下游引物的5′端分别引入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点，以便扩增的目的cDNA插入载体，扩增片段理论长度为363 bp。
1.2.2 抽提总RNA 取16周龄正常雄性BALB/C小鼠附睾周围及网膜的脂肪组织，置于 TRIzol中，用电动匀浆器磨碎成匀浆，按TRIzol Reagent操作说明抽提小鼠脂肪组织总RNA。凝胶电泳鉴定总RNA的质量，紫外分光光度法检测总RNA纯度和浓度。
1.2.3 RT—PCR合成抵抗素 cDNA 0.5 μg/μL总RNA2 μL、10倍逆转录反应缓冲液2 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、50 mmol/L MgCl2 2 μL、17 pmol/μL序列特异性下游引物1.5 μL、50 U/μL RNA酶抑制剂1 μL、20 U/μL AMV逆转录酶1 μL，加DEPC处理的水使反应体积达20 μL，42 ℃孵育1 h进行逆转录反应，99 ℃ 5 min使酶失活。在一个50 μL的反应体系中进行PCR，并对反应体系中cDNA、引物和MgCl2量、退火温度、退火时间、延伸时间以及反应的循环次数进行了优化，最终反应体系中包含10倍PCR反应缓冲液5 μL 、10 mmol/L dNTP Mix 1 μL、50 mmol/L MgCl2 2 μL、17 pmol/μL上下游引物各1 μL、 逆转录反应产物5 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，加DEPC处理的水使反应体积达50 μL，热循环参数：96 ℃预变性2 min，96 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，共进行35循环，末次循环后72 ℃延伸7 min，4 ℃。 扩增产物凝胶电泳后照相。
1.2.4 PCR产物A—T克隆于pGEM—T载体 PCR产物凝胶电泳，用Qiaquick Gel Extraction Kit凝胶回收纯化，纯化的PCR产物通过T4DNA连接酶A—T连接于pGEM—T载体，重组质粒转化JM109感受态菌，蓝白斑筛选阳性菌落，挑选单个白色菌落，加入2 mL LB液体培养基中（含氨苄青霉素），37 ℃振荡增殖转化菌。用Qiaprep Spin Miniprep Kit抽提质粒。重组质粒经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定。
1.2.5 抵抗素cDNA亚克隆于pcDNA3.1（+）或pcDNA3.1（—）真核表达载体 用EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶分别对重组pGEM—T—resistin质粒、pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（—）载体进行双酶切，按Qiaquick Gel Extraction Kit推荐的方法分别进行凝胶回收抵抗素 cDNA、切开的pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（—）载体DNA， T4DNA连接酶连接抵抗素 cDNA和切开的pcDNA3.1（+）或pcDNA3.1（—）载体DNA，重组质粒转化JM109感受态菌，氨苄青霉素筛选阳性菌落，挑选3个菌落，加入含氨苄青霉素2 mL LB液体培养基中，37 ℃振荡增殖转化菌，用Qiaprep Spin Miniprep Kit从菌液中抽提质粒，送测序鉴定。
1.2.6 pcDNA3.1（—）—resistin（—）转染3T3—L1前体脂肪细胞并诱导分化为脂肪细胞 3T3—L1前体脂肪细胞以5 × 105接种于6孔板中，培养至60%～70%融合，按SuperFect Transfection Reagent说明进行操作，通过脂质体pcDNA3.1（—）—resistin（—）转染3T3—L1前体脂肪细胞，并用含终浓度为500 μg/mL G418培养液筛选将转染阳性细胞克隆。3T3—L1前体脂肪细胞按SuperFect Transfection Reagent说明进行转染，并把细胞分为下列4组：对照组（未转染）、瞬时组（瞬时转染pcDNA3.1（—）—resistin（—））、载体组（瞬时转染pcDNA3.1(—)）和稳定组（稳定转染pcDNA3.1（—）—resistin（—））。4组3T3—L1前体脂肪细胞在含0.5 mmol/L 3—异丁基1—甲基黄嘌呤、1.7 μmol/L 胰岛素、1 μmol/L地塞米松和100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养以诱导分化为脂肪细胞。
1.2.7 Western blot方法检测四组细胞抵抗素蛋白质的表达 四组脂肪细胞生长达90％融合，收集至1.5 mL EP管加细胞裂解液提取总蛋白，按Bio— Rad蛋白检测试剂说明以紫外分光光度计测定蛋白浓度，并稀释调整浓度。电泳前加入2 × SDS上样缓冲液煮沸备用。制备20％SDS聚丙烯酰胺分离凝胶及5%SDS聚丙烯酰胺浓缩凝胶，上样后恒压电泳。以PVDF膜转膜后，室温封闭1 h。用稀释为1 ∶ 1 000豚鼠抗小鼠抵抗素抗体（一抗）孵育45 min，TBST洗膜，稀释为1 ∶ 5000的辣根过氧化物酶结合的抗豚鼠IgG（二抗）孵育1 h，ECL化学发光试剂曝光X片检测蛋白条带，图像分析软件系统分析条带灰度。
1.2.8 抵抗素对3T3—L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响 葡萄糖摄取试验按上述分为对照组、瞬时组、载体组和稳定组共四个细胞组，此4组又分为加100 nmol/L短效胰岛素或不加胰岛素2个亚组，每种试验条件均重复6次进行。细胞转染后3 h诱导3T3—L1前体脂肪细胞分化为脂肪细胞，第6天90%的3T3—L1前体脂肪细胞分化为脂肪细胞，进行葡萄糖摄取的检测[8]，每孔加100 nmol/L或不加短效胰岛素，在室温下放置30 min 。每孔加入37 kBq[3H]脱氧葡萄糖，在室温下放置10 min。每孔立即加入10 ?滋L浓度为0.48 mg/mL细胞松弛素B（终浓度为10 ?滋mol/L），以终止葡萄糖摄取。细胞用冰冷的PBS冲洗2次，每孔加入0.5 g/L氢氧化钠0.2 mL，在室温放置20 min，使细胞裂解。吸全部溶液点于whatman层析纸上。层析纸置于液体闪烁瓶中，加入3 mL闪烁液，液体闪烁计数器检测样品的放射活性。
葡萄糖摄取量是根据3H—2—脱氧葡萄糖放射性比活度及所测的每分钟衰变数（disintegrations per minute,dpm）值换算，以每10 min 10 6细胞葡萄糖摄取的pmol数表示，6孔板每孔细胞数以2 × 106计算，细胞的葡萄糖摄取即为测得的dpm/［200 GBq/（mmol × 细胞数）］。数据以均数±标准差表示，组间比较用方差分析，显著性水准为小于0.05。
2 结 果。
2.1 总RNA的质量和浓度的检测。
提取的小鼠脂肪组织总RNA，经凝胶电泳后，紫外灯下呈现清淅的28S、18S和5S三条带，且28S与18S条带比例约为2∶1，表明总RNA无降解。A260/ A280为1.9，表明总RNA纯度高。总RNA浓度为0.5 μg/μL。
2.2 PCR产物凝胶电泳分析。
PCR产物凝胶电泳后，紫外灯下可见一清淅的条带位于250 bp与500 bp之间，与欲扩增抵抗素 cDNA理论长度363 bp相符（图1）。
2.3 重组质粒pGEM—T— resistin酶切鉴定。
重组质粒被EcoRⅠ和 XbaⅠ内切酶切为两条带，片段的大小与理论值pGEM—T 3000 bp和插入的PCR产物355 bp相符，表明PCR产物已插入pGEM—T载体（图2）。
2.4 重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)—resistin的鉴定。
重组质粒经双酶切反应，凝胶电泳，紫外灯下可见重组质粒被切个片段，大小与pcDNA3.1(+)理论值5 400 bp 和插入的抵抗素 cDNA理论值355 bp相符（图3）。核苷酸序列分析结果显示:插入pcDNA3.1（+）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因 mRNA编码区序列一致，且方向正确,表明已成功构建载有小鼠抵抗素基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)—resistin。
2.5 重组真核表达质粒pcDNA3.1(—)—resistin(—)的鉴定。
抽提的重组质粒，凝胶电泳，紫外灯下可见在约5 755 bp处有DNA（图4），核苷酸序列分析结果显示:插入pcDNA3.1（—）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列一致，且方向相反，表明已成功构建载有小鼠抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3.1（—）—resistin（—）。
3T3—L1前体脂肪细胞诱导分化第6天，苏丹染色后，镜下见90%以上的细胞内出现脂肪颗粒，表明已分化为脂肪细胞(图5)。
3T3—L1脂肪细胞：对照组、瞬时组、载体组和稳定组的细胞均表达抵抗素蛋白，条带灰度的均值分别为：282±75、201±49、256±86和196±52，四组间的差别有显著性（P 0.05,图6），瞬时组和稳定组的细胞抵抗素蛋白表达明显低于对照组和载体组的细胞，表明pcDNA3.1(—)—resistin(—)已成功转染瞬时组和稳定组的细胞，并在细胞内抑制了抵抗素蛋白的表达。