应用特异性噬菌体抗体克隆和筛选新的大肠癌抗原基因
【关键词】; 大肠癌。
摘要：目的; 构建人大肠癌细胞cDNA表达文库，用抗人大肠癌噬菌体抗体CH209筛选新的大肠癌抗原基因。方法; 抽提人大肠癌细胞HRT18的总RNA后分离mRNA，利用SMART(Switching Mechanism at 5th end of RNA Transcript)技术合成cDNA，与λTripIEx2载体连接包装成cDNA文库。测定原始文库的滴度和文库重组率，鉴定插入片段的大小，测定扩增文库库容量并鉴定CH209筛选的阳性克隆。结果; 原始文库滴度为6.5×106pfu/mL，重组率为97%；插入片段的大小介于0.5—2.0kb之间；扩增文库滴度为1.1×109pfu/mL，筛选后获得 10个阳性克隆，代表10个抗原基因，其中5个与已知基因高度同源，3个与已知基因部分同源，2个是新基因。结论; 成功构建了人大肠癌细胞的cDNA文库；用CH209筛选得到10个大肠癌相关抗原基因，有2个是新基因。 毕业论文。
关键词：大肠癌；cDNA文库；抗原；噬菌体人抗体；基因克隆 毕业论文。
ABSTRACT: Objective; The cDNA expression library, which was constructed with human colorectal cancer cell HRT18, was screened with the phage antibody CH209 in order to find novel antigen genes of colorectal carcinoma. Methods; Total RNA was extracted from cell HRT18 and mRNA was isolated from total RNA and then double strand cDNA was synthesized by SMART technique. cDNA was ligated into λ TripIEX2 vector and then was packaged into λ phage in vitro. The primary library was titrated and the percentage of recombinant clones were determined. The length of cDNA inserts was tested for ligation efficiency. The library was screened with phage fusion antibody CH209 and the sequences of the reacted clones were determined. Results; The primary library consisted of 6.5×106 pfu/mL, and the percentage of recombinant clones was 97%. The length of cDNA inserts was 0.5—2.0kb. The titer of the amplified cDNA library was 1.1×109 pfu/mL. Ten positive clones were obtained and derived from ten different genes. Five of these genes were high homologous to genes known in GenBank, and there were also three genes with low homology to genes known in GenBank. The remainder two genes might be novel genes by matching in GenBank with BLAST software. Conclusion; The quality of the constructed cDNA library from human CRC cell HRT18 is excellent. Ten positive clones were obtained and two of them may be novel genes. 毕业论文。
KEY WORDS: colorectal cancer; cDNA library; antigen; phage fusion antibody; gene cloning 毕业论文。
近年来国内外利用构建和筛选癌组织或细胞的cDNA文库的方法克隆了许多肿瘤相关基因和肿瘤抗原基因。然而到目前为止，关于大肠癌肿瘤抗原的筛选及鉴定研究工作国外仅有很少的几篇文献报道，国内尚未见报道。我们在多年的研究中已获得了抗大肠癌单链抗体，即CH209等。该抗体为特异性的人源基因工程抗体，免疫组化和ELISA的结果都表明能与大肠癌细胞有特异性反应，这为寻找大肠癌特异性的抗原基因奠定了基础。我们采用SMART(Switching Mechanism at 5th end of RNA Transcript)技术，构建了大肠癌细胞HRT18的cDNA文库，并用抗大肠癌单链抗体CH209对文库进行免疫学筛选及鉴定大肠癌及其相关肿瘤抗原，拟为大肠癌肿瘤疫苗的研制提供候选抗原，也有可能为大肠癌早期诊断提供血清学分子标志物。 毕业论文。
1; 材料与方法。
毕业论文。
1.1; 材料; 总RNA抽提试剂TRIzol为Invitrogen公司产品，SMARTTMcDNA文库构建试剂盒购自Clotech公司，mRNA纯化试剂盒及Packagen Lambda DNA Packing system均购自Promega公司。RPMI1640细胞培养基为华美公司产品，小牛血清购自杭州四季青公司，琼脂糖和细菌培养基均为Gibco/BRL公司产品，余为常规试剂。HRT18人大肠癌细胞株来源于人直肠肛门腺癌组织，为本室保存。采用λTripIEX2载体及大肠杆菌XL1Blue。硝酸纤维素膜购自浙江台洲四甲生化塑料制品厂。抗大肠癌噬菌体人抗体CH209为本室制备。HRP标记的羊抗M13单克隆抗体(HRPantiM13)购自Pharmacia Biotech公司。λTripIEx2插入子筛选引物：5′端引物 5′CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT3′，3′端引物 5′ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC3′。Agarose Gel DNA Purification Kit为上海生工生物工程公司产品。 毕业论文。
1.2; 大肠癌细胞HRT18 mRNA的提取; 人大肠癌细胞株HRT18总RNA抽提按照TRIzol试剂操作说明进行，按每107个细胞加入1mL TRIzol混匀，氯仿抽提、乙醇沉淀和室温干燥后，总RNA溶于无RNase的去离子水中，经紫外分光光度计测定其A260，A280吸光度值鉴定纯度，以浓度为11g/L琼脂糖凝胶电泳证实其完整性后，65℃加热10min后，加入生物素标记的Oligo(dT)探针及可结合生物素的磁珠(SMPMAS)与mRNA杂交形成杂交体，磁性吸附将杂交体从总RNA中分离，经洗脱后溶于无RNase的去离子水中，所得mRNA用于合成cDNA。 毕业论文。
1.3; cDNA的合成及酶切; 以纯化的mRNA为模板，用含有SfiⅠ酶切位点的SMART Ⅲ寡核苷酸和CDSⅢ/3′PCR引物合成cDNA第一链，再以CDSⅢ/3′PCR引物和5′PCR引物经LDPCR扩增合成双链cDNA。双链cDNA 经SfiⅠ酶切后，Chroma spin400凝胶过滤柱对cDNA进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cDNA片段。 毕业论文。
1.4; cDNA的包装及文库的扩增; 将cDNA与载体λTripIEX2按1∶1比例连接，采用Packagen Lambda DNA Packing system(Promega公司)试剂盒进行包装形成噬菌体颗粒。培养XL1Blue宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板，根据噬斑数计算文库的滴度。按照文库的滴度，继续感染宿主菌，以扩增文库。在扩增的文库加入二甲基亚砜，使其体积分数为7%，于—70℃保存。 毕业论文。
1.5; 文库的鉴定; 取扩增后的文库铺平板，同时随机挑取40个噬菌斑，用λTripIEX2插入子筛选引物，通过LDPCR扩增插入cDNA片段，扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶电泳中鉴定插入cDNA片段的大小。 毕业论文。
1.6; cDNA文库的筛选; 选用抗大肠癌噬菌体人抗体CH209对cDNA文库进行免疫学筛选，第一轮筛选将重组子转染大肠杆菌按104个克隆数铺LB平皿，42℃温育4h后，将经异丙基βD硫代半糖苷(IsopropylβDThiogalactopyranoside, IPTG)处理的硝酸纤维素膜印膜于噬菌斑上诱导蛋白质表达。硝酸纤维素膜封闭后与一抗CH209 4℃过夜，洗膜后与1∶2000的HRP偶联的抗M13单克隆抗体在室温下缓慢摇动2h，洗膜后在 DAB溶液中进行显色反应。所获阳性克隆挑出，保存于适量缓冲液中。第二轮筛选前先测定第一轮筛选所获阳性克隆的滴度，按照其滴度感染宿主菌，铺于平板中，筛选方法同第一轮筛选。不同于第一轮筛选的是第二轮筛选的目的是要排除假阳性。所获阳性克隆经第三轮亚克隆，直至得到一致的免疫阳性重组噬菌体。
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1.7; 核苷酸序列测定及其生物信息学分析; 阳性克隆PCR产物以PCR产物纯化试剂盒纯化后，交由上海博亚公司采用ABI377型DNA测序仪进行序列测定,引物序列为5′端引物序列：5′TCCGAGATCTGGACGAGC3′，3′端引物序列为： 5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′。所获克隆的DNA序列在美国国立卫生研究院提供的核苷酸数据库和蛋白质数据库中分析。 毕业论文。
2; 结 ; 果 毕业论文。
2.1; 总RNA的抽提和mRNA的纯化; 采用TRIzol试剂快速抽提HRT18细胞的总RNA，紫外分光光度计测定其A260/A280为1.91，28S和18S条带清晰，约呈2∶1关系，证明总RNA质量好(图1人大肠癌细胞HRT18的总RNA鉴定（略）)。使用磁性吸附法分离mRNA，经PCR扩增检测GAPDH无特异条带，说明RNA无污染。 毕业论文。
2.2; cDNA的克隆及文库的构建; 重组噬菌体经体外包装后转染大肠杆菌XL1Blue，经IPTG和XGal的蓝白筛选，测定文库滴度为6.5×106pfu/mL，重组率为97%。 毕业论文。
2.3; 原始文库的扩增及鉴定; 原始文库扩增后，测定文库滴度为1.1×109pfu/mL，随机挑取40个克隆经PCR法鉴定插入片段，插入片段介于0.5—2.0kb之间，平均长度为1.1kb(图2 cDNA插入片段的PCR鉴定（略）)。 毕业论文。
2.4; 第一轮噬菌体抗体筛选; cDNA文库经扩增后，用噬菌体人抗体CH209进行筛选。第一轮共对107个重组子进行筛选，共筛选出109个阳性反应克隆，阳性反应噬菌斑如图3所示。
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2.5; 第二轮和第三轮筛选; 第一轮筛选得到的109个阳性克隆，测定其噬菌体混合液的滴度，根据测定结果计算第二轮筛选所需的噬菌体混合液的量。经第二轮筛选，共获得21个阳性反应克隆，所挑取的阳性克隆基本上为单克隆。分别测定这些阳性克隆的混合液的滴度，根据测定结果进行第三轮筛选，得到一致的免疫阳性重组噬菌体，阳性反应结果如图4所示。最终共筛选得到10个阳性反应克隆。图3; 第一轮阳性噬菌斑（略）图4; 第三轮筛选的阳性反应噬菌斑（略） 毕业论文。