Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析
中国论文联盟编辑。
【摘要】 目的 克隆Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因。 方法 在已经克隆得到的Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶cDNA片段的基础上，首先通过PCR扩增得到与其相对应的基因组DNA片段，然后分别通过Mini基因组DNA文库法和Panhandle PCR法扩增其上游和下游未知片段，最后通过PCR法扩增得到类枯草菌素蛋白酶基因片段。结果 克隆得到1 519bp Pr1蛋白酶基因序列YP1977，DNAassist软件 分析 其中含有一个969bp的完整的开放阅读框，编码323个氨基酸，NCBI BlastX比对结果显示，该阅读框可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶都具有较高的同源性。结论 YP1977很可能是Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的部分片段，但仍需要进一步通过构建表达系统加以验证。
【关键词】 类枯草菌素蛋白酶；克隆；基因组文库；锅柄聚合酶链式反应 论文网。
Cloning and Sequence Analysis of Subtilisin—like Protease Pr1 Gene from Pythium sp.GY1938 论文代写。
Abstract：Objective To obtain the full—length genomic DNA sequence of the subtilisin—like protease(Pr1)gene from Pythium sp. GY1938.Methods Basing on the obtained cDNA sequence of the Pr1 from Pythium sp.GY1938,a genomic DNA fragment corresponding to the cDNA was amplified by PCR firstly. The n the upstream and downstream unknown fragments were respectively cloned by mini genomic DNA library and panhandle PCR methods.In the end,the gene fragment of the Pr1 was amplified by PCR.Results A 1 519bp DNA fragment called YP1977,in which there is a 969bp ORF coding 323 amino acids analysed by DNAassist software,of subtilisin—like protease gene from Pythium sp.GY1938 was obtained.Conclusion The fragment,YP1977,is the Pr1 gene from Pythium sp.GY1938 in all probability. However ,it must be validated further by the construction of expression system. 论文代写。
Key words:Subtilisin—like protease；clone；genomic DNA library；panhandle PCR 论文网。
蚊虫是世界性害虫，能够通过叮咬、吸血在人际间传播多种烈性传染性疾病，如疟疾、登革热等，给人类的日常生活和健康带来严重的负面 影响 ［1］。但是，由于菊酯等化学杀蚊剂的长期滥用，使得3R(再猖獗Resurgence、抗药性resistance和残毒residue) 问题 日益严重［2—3］。近年来，随着对有害昆虫进行生物综合防治的 科学 观念的推广，一种在 自然 界中能主动致病蚊虫、控制蚊虫群体的病原真菌——Pythium sp.GY1938菌株作为蚊虫生物防治的新生力量正逐渐引起人们的重视和 应用 ［4］。Pythium sp.GY1938菌株是由贵阳医学院苏晓庆教授等分离得到的一株具有自主知识产权的高效特异杀灭蚊幼虫——孑孓的水生丝状真菌，可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径，在蚊虫防治和保护人类身心健康中起着十分重要的作用［5］。通过 研究 发现，与其它昆虫病原真菌一样，Pythium sp.GY1938菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶等水解酶［6］。这些水解酶和机械压力共同作用，促进菌丝刺穿孑孓坚硬的体壁，是孑孓的主要致病因素之一［7］。因此，克隆Pythium sp.GY1938菌株侵染孑孓体壁的重要致病基因将会为研究其致病机制，通过基因工程技术改造菌株、提高菌株毒力奠定基础。 论文代写。
1 材料和方法。
毕业论文。
1.1 菌株。
Pythium sp.GY1938菌株由贵阳医学院生物防治课题组分离保存。 代写论文。
J．C D M C 2006.1.1 杨 平，等.Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析 代写论文。
JOURNAL OF CHENGDU MEDICAL COLLEGE 2006年第1卷第1期 毕业论文。
采用氯化苄法提取基因组DNA，具体步骤参照 文献 ［8］。
根据MOPAC法已经克隆得到的cDNA片段设计引物，以Pythium sp.GY1938菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增引物为A1（CTG GCC ATC CTG GTG CCG TCG）和A2（GGG CAT GGG ACA CAC GTG AT），反应程序为：95℃变性，5min；35轮循环（94℃，45s；58℃，1min；72℃，1min）；72℃延伸，10min；4℃保存。具体步骤详见文献［10］。 论文代写。
1.4 Mini基因组文库法克隆GYPR1—1上游GYGL—1片段 具体步骤详见文献［9］。 毕业论文。
1.5 Panhandle PCR法克隆GYPR1—1下游GYPHP34片段 具体步骤详见文献［10］。 代写论文。
以Pythium sp.GY1938菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增引物为V1（ACC CAT CGT CGG CAC ACA ACG GCA C）和V2（CAG TAG GCA ACA GAC AGG TGA GCA A），反应程序为：95℃变性，4min；35轮循环（94℃，45s；60℃，1min；72℃，1min）；72℃延伸，10min；4℃保存。 毕业论文。
2 结果与分析 论文网。
根据苏晓庆等采用MOPAC法克隆得到的Pr1蛋白酶部分cDNA序列设计引物A1和A2，以基因组DNA为模板，PCR法扩增得到一条530bp大小的PCR产物，命名为GYPR1—1。根据序列分析表明，GYPR1—1与已知的cDNA序列完全吻合，证明该部分基因组序列全部由外显子组成。 论文网。
采用Mini基因组文库法克隆GYPR1—1上游GYGL—1片段，克隆得到的GYGL—1长度为780bp，其中含有117bp载体pBluescript sk(—)上的序列和362bp GYPR1—1的序列，以及301bp Pr1蛋白酶基因上游未知序列。具体数据详见文献［9］。 论文代写。
2.3 GYPR1—1下游GYPHP34片段的克隆 论文网。
采用Panhandle PCR法克隆GYPR1—1下游GYPHP34片段，克隆得到的GYPHP34长度为876bp；经过序列分析和NCBI Blastn程序比对，结果显示，本次PCR扩增产物GYPHP34含有 Pr1蛋白酶基因下游853bp的未知序列。具体数据详见文献［10］。
根据上述克隆得到Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶的GYGL—1和GYPHP34 基因片段的序列，分别设计了2条引物V1和V2，克隆得到大小为1 519bp的Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶基因片段YP1977，经过序列分析和NCBI Blastn比对，表明其中包括530bp的GYPR1—1和应用mini基因组文库法获得的上游242bp未知序列以及采用锅柄PCR法克隆得到的下游747bp未知片段。由于GYPR1—1基因片段与其对应的cDNA序列完全一致，所以基因片段GYPR1—1完全是由外显子组成，其两端序列分别编码了Pr1蛋白酶保守序列（N端：G H G T H V，C端：G T S M A T P），同时，Genebank资料整理表明，该保守序列两侧300bp内不含有内含子，所以可以根据这段外显子序列在一定范围内向上游寻找起始密码子，向下游寻找终止密码子。同时，借助 计算 机辅助软件DNAssist对YP1977基因片段进行序列分析，在第230位至1119位核苷酸之间确定了一个完整的开放阅读框，长969bp，编码323个氨基酸，推测分子量为33kD,等电点为pI 5.1。NCBI BlastX比对结果显示，该基因可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶具有较高的同源性，其中与Aphanomyces astaci比对，score bits=45%,E value=2e—42,identity=213；与Chloroflexus aurantiacus比对score图1 PCR产物YP1977核酸序列及预测氨基酸序列分析 毕业论文。