雄附散治疗类风湿关节炎间质性肺病的临床和实验研究
【摘要】 目的 研究雄附散治疗类风湿关节炎间质性肺病临床效果并探讨对抗大鼠肺间质纤维化发生的机制。
方法 治疗组32例患者服雄附散加付方，对照组仅服付方，连续治疗3月。
70只SD 大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、醋酸泼尼松组（5.6mg/kg）、雄附散高、中、低剂量组（1.4g /kg、0.7g/kg、0.35g/kg）；各组大鼠于造模后的第2天开始连续4周灌胃（ig）给予生理盐水（0.014L/kg）或相应药物（0.014L/kg），28天后取右中肺组织进行HE染色和Masson染色及MDA含量、SOD和GSH—PX活性的测定。
结果 临床显效5例，有效21例，无效6例，总有效率为81.2%，与对照组比较有显著性意义（X2＝5.50,P＜0.05）。
实验HE染色和Masson染色均提示雄附散高剂量组肺组织中无明显形态学病变，肺组织中SOD和GSH—PX酶活性明显高于其它各药物治疗组(P0.01)，MDA含量明显低于其余各药物干预组(P0.01)。
可能通过提高受损组织中抗氧化酶活性水平来有效对抗肺组织纤维化过程。
【关键词】 雄附散 类风湿关节炎间质性肺病 肺纤维化 抗氧化酶类 本文根据《素问.痹论》的论述，认为类风湿性关节炎间质性肺病(rheumatoid arthritis interstitial lung disease，RA—ILD)应归属于“肺痹”，其临床表现和病理改变都符合传统中医“痰”和毒的特点，“痰积毒蚀”是其主要的病机，以散痰攻毒法治疗RA—ILD，以自拟雄附散为代表方，临床研究取得了一定的疗效。
并观察雄附散治疗博莱霉素诱导的肺间质纤维化大鼠模型组织的病变特征及该组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）等生化指标，都有明显改善，揭示了“痰积毒蚀”过程的病理机制，为临床上雄附散治疗RA—ILD提供了相关的理论依据。
1 临床观察 1.1 临床资料 2003年至2008年住院RA—ILD患者62例，采用查阅随机数字表的方法分组，随机分为治疗组和对照组。
治疗组32例，男11例，女21例，年龄48—63岁，平均52岁；对照组30例，男11例，女19例，年龄47—66岁，平均54岁。
符合类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和间质性肺病(interstitial lung disease，ILD)两个疾病标准可诊断RA—ILD。
RA根据1987年美国风湿学会标准诊断。
ILD诊断参考2002年美国胸科学会(ATS)和欧洲呼吸学会(ERS)对原发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的意见：在未作外科肺活检时，如符合下列全部主要诊断标准，以及4项次要标准中的3项，IPF临床诊断的正确性明显增加。
主要诊断标准：(1)除外已知ILD的病因，如某些药物的毒性作用、环境污染所致的ILD。
(2)异常的肺功能改变：限制性通气功能障碍和(或)气体交换障碍。
(3)双侧肺底部网状阴影，在高分辨CT上伴少许磨玻璃样改变。
(4)经支气管镜肺活检或支气管肺泡灌洗无其他疾病的证据。
次要诊断标准：(1)年龄大于50岁。
(2)隐匿起病、不能解释的运动后呼吸困难。
(3)疾病持续时间3个月。
(4)双侧肺底部可闻及吸气性爆裂音(干性或velcro音)。
中医辨证：痹证按1988年4月昆明会议的准分为风、湿、寒、热四型；血瘀证参照1986年11月广州第二届全国活血化瘀研究学术会议修订的标准；气血虚弱、肾阳虚、肾阴虚均参照1986年5月郑州全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会修订的标准。
经痰培养有明确病原微生物感染患者不纳入临床观察。
1.2 方法 所选中药饮片皆由北京普生霖药业有限公司提供的优质道地药材。
治疗组服雄附散方：制白附子2.4g，雄黄0.2g，僵蚕2.4 g，共制细粉，每日1剂，分2次以附方所煎汤剂冲服。
附方：据症状轻重、证候主次酌情选加下列药物组成：气喘用白果，麻黄；咳嗽用川贝母，枇杷叶；咳痰用瓜蒌，紫苑，痰黄用黄芩，栀子；中医辩证为风、寒、湿痹者，用抗炎止痛口服方基本方：羌活、独活、防风、细辛、稀签草、陆英、白芥子、露蜂房、徐长卿、根九节茶等，如为风湿热痹，加黄柏、生石膏；血瘀用土鳖虫、水蛭，气虚血亏用当归，黄芪，阴虚用知母、生地，阳虚用制附片、肉桂 ；皆按药典规定常规剂量，常规水煎至200ml，每日1剂，分2次，用以冲服雄附散。
两组均连续治疗3月，观察指标变化。
以后每隔1月回访1次，连续回访3次。
1.3 结果 参考ATS和ERS对IPF的意见和中华医学会呼吸病学分会2002年4月IPF诊断和治疗指南(草案)制定疗效标准：(1)显效：①症状减轻，活动能力增强；②X线胸片或HRCT异常影像减少；③肺功能改善（≥以下2项：TLC或VC增加≥10％，或至少增加≥200ml，DEco增加≥15％或至少增加3ml·min—1·mmHg—1，SaO2增加＞4%，心肺运动试验中PaO2增加≥4mmHg）。
（2）有效：①症状、②X线胸片或HRCT、③肺功能等3项中改善1—2项，改善项目数＞加重项目数。
(3)无效：症状、X线胸片或HRCT、肺功能3项均无变化或≥以下1项：①症状加重，特别是呼吸困难和咳嗽；②X线胸片或HRCT上异常影像增多，特别是出现了蜂窝肺或肺动脉高压迹象；③肺功能恶化（≥以下2项：TLC或VC下降≥10％或下降≥200m1，DEco下降≥15％或至少下降≥3ml·min—1·mmHg—1，SaO2下降≥4％，或运动试验中P（A－a)O2增加≥4mmHg)，加重项数目≥改善项数目。
用SPSS12.0软件包进行统计学分析。
1.3.1 临床治疗效果:治疗组32例，显效5例（15.6%），有效21例（65.6%），无效6例（18.8%），总有效率为81.2%；对照组30例，显效1（3.3%）,有效15例（50%）,无效14例（46.7%），总有效率53.3%。
两组总有效率比较有显著性意义（X2＝5.50, P＜0.05）。
1.3.2 CT（含高分辩CT）观察结果: 治疗组32例，改善22例，无改善10例（含加重），有效率68.8%；对照组改善12例，无改善18例（含加重），有效率40%。
两组有效率比较，有显著性意义（X2＝5.17，P＜0.05）。
1.3.3 肺功能测定结果:治疗组32例，改善23例，无改善（含恶化）9例；有效率71.9%；对照组30例，改善13例，无改善（含恶化）17例，有效率43.3%。
两组有效率比较，有显著性意义（X2＝5.18，P＜0.05）。
2 实验研究 2.1 材料与方法 2.1.1 主要试剂与仪器: 雄附散(由雄黄粉0.1g，制白附子粉1.2g，僵蚕粉1.2g组成)。
醋酸泼尼松片(天津太平洋制药有限公司，规格5mg)。
注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社，规格15mg，产品批号870690）。
SOD、MDA、GSH—PX检测试剂盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物公司。
722可见分光光度计, 恒温水浴箱，PH计。
2.1.2 实验动物: 雄性SD大鼠（SPF级，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK—(军)2002—001）, 体重(206±16)g。
2.1.3 实验动物造模:1.5%戊巴比妥钠ip 麻醉(0.25mL/100g) 后将大鼠固定, 颈部消毒,切开颈部皮肤, 逐层剥离,暴露气管, 然后向气管内注入0.3mL博莱霉素生理盐水溶液(1.5mg/200g) 或生理盐水溶液, 继续注入0.3mL 空气, 注后立即将动物直立并旋转, 使药液在肺内均匀分布。
其中假手术组大鼠肺部注入等体积的生理盐水, 正常组大鼠不做任何处理。
试验期间饮水与进食不受控制。
2.1.4 分组和给药: 将70只SD 大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、醋酸泼尼松组、雄附散高、中、低剂量组, 每组10只。
醋酸泼尼松片, 使用时分别用蒸馏水溶解, 配成混悬液备用。
其中正常组、假手术组、模型组大鼠分别ig生理盐水0.014L/kg。
强的松组ig给予醋酸泼尼松混悬液, 剂量为5.6mg/kg。
雄附散高、中、低剂量组分别ig 1.4g/kg、0.7g/kg、0.35g/kg 雄附散, 各组大鼠每天ig体积相等(按体重计算)。
每周连续给药6d,共给药4周。
2.1.5 取材、组织学染色及SOD、MDA和GSH—PX的测定各组动物于给药结束后断头处死，取部分右中肺组织用4％多聚甲醛溶液固定后常规石蜡包埋、切片，做HE染色和Masson染色；同时取部分右中肺组织用冰冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干后称重。
加入9倍体积预冷的匀浆液（pH7.0, PBS为400g/L的蔗糖液）后进行冰浴匀浆，4000r/min离心10min，取上清液按试剂盒测定方法要求进行分析。
肺匀浆中蛋白总含量用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定。
考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒与SOD、MDA和GSH—PX三种酶活性检测试剂盒均购自南京建成生物公司，具体操作方法和试剂、缓冲液配制按试剂盒说明书进行。
2.1.6 统计学处理 数据用SPSS12.0软件包进行统计学分析，结果以x—±s表示，用单因素方差分析进行多组间比较及两两比较, P0.05。
2.2 结果 2.2.1 病理组织学检查 2.2.1.1 肉眼观察 正常对照组与假手术组肺外观呈粉红色，表面光滑，质软；模型组肺组织颜色较深，多呈灰白、灰红及暗红相间，质稍硬；醋酸泼尼松组与雄附散中、低剂量组的肺组织表现较为相似，多呈灰红与暗红相间，部分区域质微硬；雄附散高剂量组肺组织多呈粉红与暗红色相间，质软。
2.2.1.2 HE染色及Masson染色镜下观察 正常对照组与假手术组肺组织肺泡壁上皮及肺间隔内血管均未见明显异常，无炎细胞浸润现象，Masson染色未显示肺泡间隔内有胶原纤维增多现象；模型组肺组织肺泡壁上皮部分缺失，肺泡间隔明显增宽，其内血管充盈，纤维组织增生，呈以淋巴细胞为主的炎细胞浸润现象，Masson染色显示肺泡间隔内胶原纤维明显增多，部分肺泡腔内有渗出物；醋酸泼尼松组与雄附散中、低剂量组的肺组织肺泡壁上皮无明显缺失，肺泡间隔稍增宽，部分区域内呈现血管充盈、纤维组织增生以及以淋巴细胞为主的炎细胞浸润现象，Masson染色显示部分区域肺泡间隔内胶原纤维含量稍有增加，肺泡腔内无明显渗出物；雄附散高剂量组肺组织绝大多数区域肺泡壁上皮及肺间隔内血管未见明显异常，除个别肺泡间隔内有少量淋巴细胞浸润现象，Masson染色未显示肺泡间隔内有明显胶原纤维增多现象。
2.2.2 各组大鼠肺组织中SOD活性变化 假手术组大鼠肺组织SOD酶活性与其余各组相比均呈明显上升趋势，达到822.71±48.51U/mgprot (P0.01)；模型组肺组织SOD酶活性与其它各组比较，均呈明显下降趋势，为483.17±30.64 U/mgprot (P0.01)；与模型组相比，醋酸泼尼松组和雄附散高、中、低剂量组大鼠肺组织中SOD酶活性均明显增强(P0.01)，其中雄附散高剂量组肺组织SOD酶活性升高最明显（749.45±45.64 U/mgprot），醋酸泼尼松组肺组织SOD酶活性高于雄附散中(P0.01)和低剂量组(P0.05)；雄附散中、低剂量组间比较SOD酶活性变化无显著性差异(P0.05)。
2.2.3 各组大鼠肺组织中MDA含量变化 正常对照组、假手术组和雄附散高剂量组肺组织MDA含量较其它组均明显下降(P0.01)，但三者之间比较MDA含量变化差异均无显著性（P0.05）；模型组肺组织MDA含量明显高于其它各组，达36.23±11.54nmol/mg (P0.01)；醋酸泼尼松组与雄附散中、低剂量组的肺组织MDA含量明显高于模型组(P0.01)，但三者之间比较MDA含量变化差异均无显著性（P0.05）。