藻酸钙的特性及在软骨组织工程的应用
软骨缺乏血运，仅靠关节滑液提供大部分营养，因此软骨组织的自身修复能力极其有限，一旦损伤难以修复，继发的创伤性关节炎、关节退行性变、关节僵直将会导致严重的功能障碍。现代外科的发展实现了人类替换病损组织的梦想，用于替换病损组织的材料包括异种、同种异体、自体组织和人工合成材料，但是这些代替材料均有一定的局限性。1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出了“组织工程”这个名词，1988年被定义为“应用生命科学与工程科学的原理和方法，在可控、可重复的条件下，通过哺乳动物、人类(包括患者本身）特定细胞在网络构架上的体外培养及体内移植，形成具有特定功能的组织和生物替代物”。因此，组织工程不仅要求合适的种子细胞，还需要合适的载体来携载种子细胞。藻酸钙是一种理想的携载软骨细胞的材料，它具有良好的生物相容性、可降解性〔1~5〕，除了能够提供细胞生长所需的三维生长支架外，还能创造类似软骨基质的环境，维持细胞的表型及其表达。
细胞外基质是细胞附着的基本框架和代谢的场所，其形态和功能直接影响着组织的形态和功能，其替代物的研究一直是软骨组织工程的关键。合成或天然的基质支架为植入的细胞提供了依附的支架和可控制的环境，控制细胞的生长，并在植入时作为细胞的载体。理想的软骨组织工程基质支架应具有以下特性〔6〕：（1）具有良好的生物相容性，在体外培养时无细胞毒性，植入体内时不会引起机体炎症和排斥反应；（2）具有三维立体结构；（3）具有良好的表面活性，能促进细胞的粘附并为细胞在其表面的增殖提供良好的微环境；（4）具有生物可降解性；（5）具有可塑性。目前，常用于软骨组织工程的支架材料主要有2类，即合成高分子材料，如聚羟基乙酸、聚乳酸和两者的共聚物以及聚氧化乙烯等；天然高分子材料，如胶原、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白以及琼脂糖等。天然高分子材料按形态可分为预制成形的三维多孔支架和水凝胶材料。
水凝胶是一类在水中溶涨并保持大量水分而又不溶解的聚合物，通过改变温度、酸碱度、经紫外线照射或者加入交联剂等方法，可使水凝胶由液态转变为固态并可任意塑形。利用这一特点，以水凝胶负载软骨细胞通过关节镜注入软骨缺损区并在原位凝胶化，可以最小限度的减少创伤，符合现代微创手术的要求，且不受软骨缺损形状、大小和深度的限制；与预制成形的多孔支架相比，软骨细胞和基质在水凝胶中分布更为均匀，凝胶化后可以减少细胞从多孔支架的逸出〔7〕，且不受材料厚度的影响。因此水凝胶类材料在修复软骨缺损中具有独特的优势。藻酸钙是一种理想的水凝胶载体材料，广泛应用于医学领域。
藻酸钙来源丰富，价格低廉，无毒无气味，具有可吸收性、可注射性和良好的生物特性，在生物医用领域得到广泛应用，已经美国FDA批准成功地应用于药物剂型研制、伤口敷料及食品工业中的浓缩剂和乳化剂，也是口腔修复科中常用的塑形材料。
藻酸钙是由不同数量的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸形成的多聚糖，它不仅在2种单体的数量上多种多样，而且在排列序列上也是不同的。由离子交联形成的藻酸钙凝胶的物理特性决定于多聚糖的组成、序列和聚合物的分子大小〔9~10〕。藻酸钙的强度随藻酸钠和氯化钙浓度的不同而改变。藻酸钙凝胶多聚体中有4种二聚体序列结构，即Fgg，Fmg，Fmm和Fgm(G=古洛糖醛酸，M=甘露糖醛酸），藻酸钙凝胶的弹性与其二聚体的含量相关〔9〕。如果古洛糖醛酸的量超过总量的70％，就能使形成的藻酸钙凝胶具有最低的皱缩、最高的力学强度、高孔隙率以及在一价离子溶液中较高的稳定性〔7〕。血清蛋白在藻酸钙凝胶中的扩散与甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的量有关，古洛糖醛酸聚合链的强度比甘露糖醛酸聚合链的强度大，而两者的强度又比古洛糖醛酸和甘露糖醛酸交替聚合链的强度大，而高强度的古洛糖醛酸片段不利于形成藻酸钙凝胶的相邻链靠在一起，因此分子间的溶质的运输随古洛糖醛酸的量的增加而增加。当有钙离子鏊合剂如枸橼酸盐、乙二胺四乙酸、磷酸盐等去除钙离子后，凝胶会很快溶解〔12〕。藻酸钙凝胶可以在pH78的条件下完全溶解在01 mol/L的柠檬酸钠溶液中，低含量的古洛糖醛酸或低分子量的藻酸钙凝胶在柠檬酸钠溶液中的溶解更快。
藻酸钙凝胶包裹细胞的技术，广泛应用于细胞的培养、植物的微组织繁殖、杂交瘤抗体的生产，以及动物细胞的移植等〔12〕。虽然各种方法的应用对藻酸钙凝胶的理化性质有不同的要求，但其形成机理是一样的。
海藻酸及其衍生物是一种从海洋褐色藻类中提取的亲水性胶态多糖类聚合物，它是自然界β(1，4）D甘露糖醛酸和α(1，4）L古洛糖醛酸的线性高分子化合物。每个海藻酸及其衍生物的大分子中都含有能与多种金属离子反应形成凝胶的羧基和羟基。如将海藻酸钠加入含钙离子的介质中，钙离子将置换海藻酸钠大分子中的部分氢离子和钠离子而转化为海藻酸钙分子，反应式为Ca2++HALg+NaALg=Ca(ALg）2+H++Na+。故凝胶体中同时存在NaALg、HALg和Ca(ALg）2结构的相互交错连接。由于各自的结合力不同，使形成的藻酸钙凝胶大分子结构的空间连接力也不平衡，而钙离子在整个体系中起主导作用，有助于把分子连在一起，这种形成的三维结构叫“鸡蛋箱”结构〔13〕。一价离子和镁离子不能参与藻酸钙凝胶的形成〔14〕，而Ba2+和Sr2+产生的藻酸钙凝胶比钙离子产生的凝胶强度大〔13〕，藻酸盐还可以和其他二价离子交联形成便于细胞固定和药物包裹的凝胶，而有些离子的亲和力比和钙离子的亲和力大，和二价离子亲和力依次为Pb2+＞Cu2+＞Cd2+＞Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞Co2+=Ni2+=Zn2+＞Mn2+〔12〕。研究显示〔11〕：除了Cd2+和Ni2+，藻酸钙凝胶的强度随亲和力的增加而增加，但这些离子中部分离子有毒性，如Pd2+、Cu2+、Cd2+等。Sr2+、Ba2+、和Ca2+常用于包裹活细胞凝胶的形成，但最常用的还是Ca2+离子。
按12％(w／v）的比例把藻酸钠溶于蒸溜水。藻酸钠溶液的消毒可以用高压消毒，也可以用过滤器过滤消毒，采用高压消毒前把藻酸钠溶液的pH值调整到70~80。用消毒好的藻酸钙溶液和离心分离得到的细胞混合液，通过直径022~10 mm的注射器距102 mm的氯化钙液面20 cm分滴滴入氯化钙溶液，形成包裹细胞的藻酸钙微囊。也可以把混有细胞的藻酸钙溶液淹没在102 mm的氯化钙溶液，形成一定形态的包裹细胞的藻酸钙凝胶。如果想把细胞从藻酸钙凝胶中提取出来，可以用50 mm的柠檬酸钠在pH70的条件下提取出来〔6〕。
软骨细胞是软骨组织的细胞成分，他们分泌软骨组织特有的基质，这些基质主要包括Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ〔15〕和X〔16〕型胶原，以及蛋白多糖聚合体〔17〕。但是当软骨细胞单层培养，容易去分化表现出成纤维细胞的表型，分泌Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ胶原，及多功能蛋白聚糖〔18〕。藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养，藻酸钙凝胶表面积大，内部孔隙多，适合于细胞黏附和进行营养交换，能够维持细胞的球形形态，而球形结构的维持对软骨细胞的表型的维持非常重要〔19〕。软骨细胞可用柠檬酸钠从藻酸钙中解离下来。Guo等首次报道了用藻酸钙凝胶培养软骨细胞的方法〔10〕。软骨细胞在藻酸钙微囊中培养未见去分化，而且随时间的延长在藻酸钙中培养的软骨细胞基质越来越多〔21〕，如Hans报道〔22~23〕软骨细胞在藻酸钙培养8个月，软骨细胞持续增值，而且分泌软骨细胞特有的Ⅱ型胶原、agrecan，丰富的细胞外基质围绕于细胞的周围，形成的组织经组织学、生化检查发现，该组织类似于正常软骨组织。还有研究报道在藻酸钙微囊中培养软骨细胞所形成的基质与真正的软骨基质非常类似，而且与软骨细胞有关的agrecan的浓度也类似于真正的软骨组织的浓度〔23〕，这些研究提示，藻酸钙凝胶能提供软骨细胞生长的微环境。
各种形态及大小的藻酸钙凝胶作为组织学工程载体的应用越来越普及，悬浮有兔自体软骨细胞的藻酸钠和氯化钙相混合，修复自体全厚软骨缺损，观察4~6个月发现缺损区有正常的软骨组织修复〔24〕。用不同比例的聚乙醇酸和聚乳酸及悬浮有自体软骨细胞的藻酸钙修复兔滑车关节全厚骨软骨缺损(4 mm×4 mm），观察12周，缺损区软骨组织修复满意〔25〕。还有把悬浮有软骨细胞的藻酸钠液体置于缺损处，再加氯化钙，使形成的载体细胞复合物正好把缺损填充并和周围紧密结合。也有先把藻酸钙凝胶冷冻干燥形成载体，然后再把细胞按一定的浓度种植于表面，再回植于体内使其成软骨。