抗疫病变异体．PDF

利用组织培养技术筛选辣椒 抗疫病变异体 齐飞，巩振辉，黄炜 (廉北农林科技大学E1艺学安•陕丙畅凌712100) r« S］选用“2OO1 = “2O56J“2O31”3个辣戡品沖作为试材•以其子叶作为外柚体诱导愈伤姐纨•以辣戡疫 狷榴廉藏培养建蔽制取作为筛选剂•席选辣壇抗疫病细胸变界系.纳果表明•辣檄疫病病对煤椒 子叶愈伤组织的诱辱.生长及不定芽的分化具有显着的抑制作用•抑制作用度的堆加而堆加•且不同 辣椒品种愈伤组织对毒素的忍耐力不同. ［■关■闻〕疫筋病晾蔚;粗毎变异系；愈伤组织 ［中图分类号］S641.303. 53 ［文敵标识矶］A ［文韋细号］1671—9387(2006)02—0083—06。

辣械疫病是危霑辣椒生产的主要病害之一 •在 世界许多国家都有发生.该病害定由辣椒疫病病原 菌(Phylophthora capsici)引起的一种毁灭性土传病 害，对苗期.成株期辣椒均有伤害，茎、叶和果实均能 发病•且其传播速度极快，常致使发病田绝产•造成 严重的经济损失“利用化学药剂对植株地上部进行 喷施防治的传统方法，不仅污染产品和环境•而且防 治效果较差。但是采用常規育种和杂交育种技术进 行辣椒抗疫病育种工作•也具有脊种周期较长、难以 在短时间内获得优质抗病品种的缺点。因此•寻求一 种新的，效果好、周期短的抗病育种途径•已成为辣 掀高产优质抗病育种研究的噫点. 近年来，植物离体培养篩选细胞突变体技术迅 速发展，国内外已建立了较为完善的利用组织培养 技术•离体筛选抗逆种质的新方法，并在植物抗病、 抗除草剂.附盐胁迫、抗金属离子.棣性不育和作物 品质改良等方面取得了可喜成就•获得了大母的突 变体材料⑴。如何诱导并成功筛选出辣椒的抗疫病 体细胞变异无性系在国内外尚未见报道。基于此•本 试验建立和完善了辣嫩抗疫病体细胞变异无性系诱 导筛选体系•并在此基础上获得了抗疫病的体细胞 变异株系•这对于加速辣椒抗疫病新品种的选育和 推广，及对农业可持续性发展具有虫要的理论和实 践意义。

 1材料与方法 1・1材料 选取树2001”.“2056“和“203L3个辣椒品种 (系)作为试材•其中品种“2001”为市售种•品系 “2056”和“203】”由西北农林科技大学园艺学院辣椒 种质资源与育种课题组提供。3个供试材料均为辣 拟疫病感病品种(系〉。

辣椒疫病病原菌为陕西杨凌本地分离菌株.辣 愎愈伤组织诱导分化培养基(MS+质fit分数3 %蔗 黯+质罐分数0.6 %琼脂+ 5. 0 mg/L BA + 0. 5 mg/L IAA)ffi 1 moI/L NaOH 或 1 moI/L HCI 调 pH为5・8•并在0・10〜0・15 MPa压力和121〜126 C高温下灭菌20 miru用于愈伤组织的诱导及不定 芽的分化。

1・2方法 1.2.1躱救无苗苗的获得 精选后的辣椒种子经 55 C温水浸泡2 h.体积分数70 %酒箱稷泡40 “ 质址分数2 %次氯酸例溶液消稚30 min,无菌水漂 洗3〜4次，接种到MS+质就分数3 %蔗糖十质敌 分数0・6 %琼脂培养基上(pH = 5.8)，S于光照 2 000 Lx(14d),白天26 C.晚上20 C条件下发芽 并培育成苗。

1.2.2 嫌椒疫炳病原荫粗奉素的制备 辣椒疫病。

［ttMR 期］200S—06—08 ［慕金项R］国家白然科学茎金項目(30571262).因北农林科枝大宁遗传育种专項(O5YZO24—1) ［ffata介〕齐 飞i98i—.女・次西汉中人•橫士•主宴从事农立生詢技术«». 〔通讯作右〕巩振矫〈1957—・男•陕四礼泉人•氢厲・博士•博士生特紳•主要从事蔬菜种植贵卑生物技术研究• E—nuil igzhhl63@/yahoo ・ com. cn 滞原 （Phytophthora ca/sici Leonian）^ 进行液体 培养材7 d接种至PDA固体培养基上进行繁殖和 鉴定，挑取5块农径8 mm的单繭菊落接种于100 m!•胡妙卜汁培养液中（CFB）,g 27 C黑暗条件 下—110—120 r/minfis荡培养18d,用双层灭菌滤 纸滤去荫丝体•滤液经4 000 r/min离心20 min•上 淸液煮沸过滤即为辣椒疫病病原菌粗毒素. 1. 2. 3 媒奴疫病病原苗根*索对•檢椒子叶愈伤组 织讲字的形旳 分别选取3个辣椒品种12 d苗龄 幼苗的子叶•接种在粗秦索体积分数分别为0 %, 10 %.20 %.30 %,40 %.50 %和60 %的筛选培养 基上•毎处理50个外植体。接种时外植体伤口与培 养基表面充分接絶•无繭苗的生长条件为：温度20〜 25 C •光照2 000 Lx, 14 h光/10h 愈伤组织的 诱导、继代与分化培养条件为：温度20〜25 C•光照 2 000 Lx.H h光“0 h暗,20 d后分别统计各试验 材料愈伤组织诱导率及发佇状态。

1. 2. 4 辣椒疫病病原苗相#素对林椒愈伤组织增 殖的影响 分别选取3个辣椒品种12 d苗龄幼苗 的子叶接种在分化培养基上•毎处理100个外植体。

接种时外植体伤口与培养菇表而充分接触•培养条 件同1.2.3,培养20 d后将愈伤组织从外杭体伤口 处切下•转接至粗裨素体积分数为10 %的筛选培养 基上继代筛选堆养•用精确度为0・001 K的天平称 議不同处理各个材料愈伤组织鲜垂.培养20d^・ 选择3个品种未褐化且生长明显的愈伤组织•转接 至粗毒素体积分数为20 %的筛选培养基上进一步 继代筛选培养•用梢确度为0・001 g的天平称就各 个材料愈伤组织鳞电・20 d为1个粗毒寮浓度筛选 周期•食伤纽织筛选的粗毒索体积分数最高为 60 %.在每个粗毎索筛选周期•观察各个材料各个 处理的愈伤组织的生长状态•并称秋其愈伤组织鮮 重肿算愈伤组织増殖率，计算公式如F：

愈伤组织增殖率/%□（（培养后愈伤组织址一 转入愈伤组织墮）/转入愈伤组织fi）xioo %。

1.2.5 辣椒疫病病原菌祖命素对林椒愈伤组织分 化的影响 方法同1.2.4,在毎个粗潅索体积分数 籀选周期•均统计不同材料冬个处理的不定芽分化 率、毎个愈伤组织的存活率和不定芽生长状态。

1.2.6 抗性细胞系的筛选与稳定性養定 分别将 3个品种在粗毒索体积分数为60 %筛选培养基上 生长的愈伤组织•转接至无毒索协迫的MS培养基 上维代增殖4次•以洶汰对粗恋素嗜好的适应细胞. 再分别将M200r＼M2056＼2031“抗性变异系及其对 照系，转接至粗毒喫体积分数为60 %的筛选培养基 上进行培养•研究抗性无性系的抗巌素待性。并统计 各处理的愈伤组织存活率及愈伤组织增殖率占 1.2.7扶性也胞系的植株再生 将抗性愈伤组织 分化的不定芽丛分割•转人芽伸长培养基上•培养条 件同l・2・3.14d继代I次。不定芽叶片开展•同时 有茎何伸长。待不定芽长至2—3 cm时•将其从基部 切卜••插入生根培养基中诱导生根•待其长成发达根 系后•移人盛有菜园土和蛭石（质械比为1二1）的肯 养钵中保湿培养. 2结果与分析 2. 1練椒疫病病原茵粗■素对猱議子叶敌伤组以 诱导的形响 山表1可以看岀•辣椒愈伤组织诱导率86希辣 椒疫病病原菌粗毎素浓度的升髙而降低。当辣椒疫 病病原帝粗靈素体积分数为10 %时「2001”、 “2056“和“2031”的愈伤组织诱导率分别为90 %■ 88 %和86 %。当粗毒素体积分数为60 %时・ •2OOLJ2O56”的愈伤组织诱导率分别为4 %和 2 %■而“2031”在粗诱索体积分数为50 %时就已无 愈伤组织产生，这说明辣椒疫病病原菌粗枣索对辣 揪愈伤组织有强烈的褂害作用。除了粗滞素体枳分 数为0%处理外•在粗奉索体积分数相同的条件下• “2001”的愈伤组织诱导率明显髙于M2O31 ＼这说明 不同辣椒品种愈伤组织对襌索有不同的忍耐力. “2001“对粗奇素的忍耐力最强广2031“最弱。本试验 还发现•生长花含有粗磁集培养基上的为3个辣椒 品种•其愈伤组织均出现了不何程度的悔化•且粗毒 素体枳分数越高•福化现氟越严电“ 2.2猱椒疫病病原■粗■素对伤组织增殖 由表2可知，用辣椒疫病病原菌粗廓素筛选辣 緻愈伤组织时•随粗毒索体积分数的升奇•愈伤组织 受到抑制的程度增强。当粗毒素体积分数为10 % 时广2001貫“2056”和“03】”的愈伤组织生长状况良 好•新鲜均匀疏松•淡绿色•愈伤组织的增弟率分别 为89.6 %,88. 9 %和86・2%・当粗產索体积分数 为60 %时•仅有个别愈伤组织存活广2001化“2056” 和H2O31w愈伤组织的增殖率分别为1 7 %. 15.3 %和1】・6 %。

»1不問体积分敷粗•康对UMt子叶愈伤組织诵辱的影* Table 1 Effect of crude toxin on inducement of callus of pepper 体积分数/% Crude toxin concfn— iraiionH Variety 外植体敗 No. of explancs 魚伤 组妃数 No. of callus 金伤组级 携卄/% Rate of callus induced 体积分效/% Crude foxin concen* traiionK 品种 Variety ft ft 外 No. of explantn 倉伤 No. of callus 金伤组块 Rme of callus tnduerd。

200! 50 50 100。

2001 50 1) 22 0 2056 50 49 98 40 2056 50 7 U。

203】 50 50 100。

2031 50 5 to。

2001 50 45 90。

2001 50 5 to 10 2056 50 44 88 50 2056 50 3 6。

2031 50 43 86。

2031 50 I 0。

2001 50 34 68。

2001 SO 2 4 20 2056 50 30 60 60 2056 50 1 2。

2031 50 28 56。

2031 50 0 0。

200) 50 25 50。

30 2056 50 20 40。

2031 50 17 34。

«2 对伤组织增療的序* Table 2 Effect of crude toxin on growth of callus of pepper 伟尉富％ 品种 i?盘鵲 ＼ ^SSS/% SmS/% 蓟溜『 Crude toxin Variety Rate of growth Growth | Crude toxin Variety Rote of growth Growth concent ratKn« of callun !«tate concent rn lions of cxllus stjiie。

2001 96.5 + + + + +。

200) 34.5 + + + 0 2056 94.3 + + + + + 40 2056 32.6 + + +。

2031 93・6 + + + + +。

2031 30.8 + +。

2001 89.6 + + + + +。

2001 20.9 +十 10 2056 88.9 + + + + + 50 2056 19. H + +。

2031 86.2 + + + +。

2031 】5・9 +。

2001 69.6 + + + +。

2001 16.7 + 20 2056 6 J + + + # 60 2056 15.3。

2031 63.4 + + +。

2031 11.6 +。

2001 50.2 + + +。

30 2056 48・6 + +十。

2031 40.9 + + +。

注，+ + + +十.@伤ffltHUHL赣鲜均匀欣松•湊结色・+ + + +・金伤IU9L负■较好•较競勢疏松•黄绿色・+ + +・】/3愈伤A1CI质債幣. 黄色i + 色)+・大部分倉伤組伙福化死亡•只确•个别存活. Note $ 十 + •♦• + + ・ means callus grows well ・ Kght green ■ + + + +・ mc«nx callus grows good ・ yellow・grecn $ + 4» + • mean% 1 /3 callus grows in bad condition・ycllovu + + ・mcan» 1/2 cullu* growjc in bud condition• yellow—brown； + ・ mcen。most o( calluR died・ 2.3練議疫詹病原VS««对楝椒您伤组织分化 的影响 由表3可知•辣锻疫病病原菌粗孝素能显著抑 制辣椒子叶食伤组织分化不定芽•且随君粗毎素体 积分数的升高•愈伤组织存活率降低•不定芽的分化 率也显苦降低.当粗雄素体积分数为10 %时， —200r^2056w和“2031”愈伤组织不定芽的存活率 分别为88.5 %.85. 6 %和81.8 %•分化率分别为 84.2 %82. 3 %和7 6 %•此时不定芽生长基本 正常，长势较对照稍弱。当毒素体积分数为60 %时，m2001＼m2056h和“2O3L愈伤组织不定芽的存活率 分别为15・8 %・14・5 %和 6 % •分化率分别为 用. «3不同体积分对練複@伤组録分化的影購 Table 3 Effect of crude toxin on differentiation of callus of pepper 10.2 %.8・1 %和4・3 %•此时不定芽枯黄甚至死 亡.粗毒索对“203L不定芽的稚宮作用强于其他2 个品种，说明粗侮素对不同辣徵品种不定芽具有不 同的毒害作用。以上结果均表明•辣椒疫病病原菌粗 毒素对辣織不定芽的分化和生长有强烈的冬害作 体枳分败/% Crude toxin concern rat ion% A# VArieiy 化棋/% R*ie of di(krcnU8iion of callu5 .eftfii 织 不定芽存活車/% Rite of living callus 主长状念 Growth Mute of call”。

200! 95. ＼ 100.0 分化 Sirong differeniiation 0 2056 94.3 100.0 分化 Strong Afferentialion。

2031 90.5 90 分ft Strong diffrrrntiAtion。

2001 84.2 88・5 分化弱 Weak differrnimiion 10 2056 82.3 85.6 分化％ Weak differenlMKion。

2031 78・6 Al.8 分化将 Wenk differeniiation。

2001 75.6 78.4 停止分化 No differenuaiion 20 2056 73.1 77.5 停止分化 No diffcrcntuiion。

2031 65.8 72.2 停止分化 No diffrrcntialMJn。

200! 60. 4 63. H 雄殊岀现褐化 Basilar lis^ue npf»eared bruising 30 2056 59.3 61.2 基部岀 liflilar lr*ue Appeared bruising。

2031 53.9 52.6 BMlar (isMue bruised totally。

2001 3 8 S3. 7 系部得化 tU«ihr lixxuc brui^d tomlly 40 2056 36.5 29—5 化 liAxthr ti%xue bruised family。

2031 29. 7 23.9 化 Top of buds bruised toullv。

2001 19.6 23.6 芽尖鸭化 Top of bod, bruiMid lotally 50 2(156 16.8 21,2 芽尖甥化 Top of buds bruised totally。

2031 11.4 15.4 枯貧、死亡 Perished end died。

2001 10.2 15.8 死亡. Pcn»hcd And died 60 2056 8・1 14.5 枯酋•死亡 Perished »nd died。

2031 4.3 6 怙赏•死亡 Peris bed and dx?d。

2.4抗性细胞礙S定性分析 抗性细胞系稳定性分析结果见表4.由表4可 知•辣椒抗疫病愈伤组织变异系与其对照系在含有 相同体积分数粗磯素的培养基上培养时•两者的存 活率和增殖率存在明显差异。庄体枳分数为60 %的 粗毒亲培养基中培养时•抗性愈伤组织仍有一定的 生长蜀，而对照则受到很强的抑制•“2001”・“2056“ 和“2031“抗性愈伤组织的存活率分别为85.3 %■ 83.8 %和80.9 %•对照愈伤组织的存活率分别为 8. 9 %■8 %和3・8 %。“200172056”和“2031” 抗性愈伤组织的增殖率分别32・8 %.30・3 %和 25.1 %■对照愈伤组织的增值率分别为5・3 %■ 4.8 %和4・3 %。以上结果均表明•经粗毒索连续筛 选得到的抗性细胞变异系对辣椒疫病病原菌粗旅索 具有稳定的抗性。但这种抗性是否能够稳定遗传及 抗性细胞系的再生植株能否抗病•还需进一步研究。

证实。

*4浹性fan*%定性分析 Table 4 An^ly^is of resistibility of cell mutant lines 41* Variety .!伤率Rate of growth of callus 敢伤ttl织存沾車/% Rate of living c^lluti of pepper 变# 至 Trentmenl CK 变异疾Treatment 对頸紊CK 2001 32.8 5.3 85.3 9 2056 30.3 4.8 83・8 6.8 2031 25.1 4.3 80.9 3.8。

2.5抗性细胞系植株的再生 本试验获得辣椒品种“2001”抗疫病再生植株 15株，获得辣椒品种“2056”抗疫病再生植株12株， 获得辣椒品种“2031”抗疫病再生植採8株，对辣锻 抗疫病再生植株的抗病性鉴定还有待进一步研究. 3讨论 体细胞无性系变异几乎可以发生在植物所有的 器官.组织.细胞及愈伤组织上。许多利用组织培养 进行植物育种的研究发现•在组织培养过程中可以 发生丰富的变异•待别是处于去分化状态的愈伤组 织•本身就是体细胞无性条变异的主要原因。组织培 养是一个新的、非常丰富的遗传变异源泉，因此，本 试验在筛选方法上只足将愈伤组织接种于选择培养 基上，而未对原始材料进行任何其他诱变处理.植物 病原毒索足病原菌产生的奇性代谢产物，在寄主植 物病害的发生、发展过程中起明显的致病作用.研 究3⑷表明•祗素不仅对植物的组织、器官有毒害作 用，还对植物离体培养细胞也有明显的毒害作用，可 将毒索作为选择剂对愈伤组织进行抗性筛选•以获 得抗性细胞变异系。赵晓明等⑺将番茄愈伤组织转 接于含番茄早疫病粗命素的培养基上发现•随毒索 浓度的增加，愈伤组织增殖率明显降低•褐化现第加 蛋。刘进平等⑹报道•辣椒疫離培养滤液对胡感茎尖 和丛生芽的存活和生长均右抑制作用•且随滤液浓 度的升高•茎尖和丛生芽的存活率和生长率均下降• 马龙彪铮⑼报道•甜菜褐斑病培菲滤液对愈伤组织 的诱导率和再生苗率均有一定的抑制作用。本研究 则发现•辣椒疫病病原繭粗矗素对辣椒愈伤组织的 诱导及增殖有明显的抑制作用，且抑制作用随粗牡 素体积分数的增加而增强。山此可见,病原菌粗毎素 对离体细胞的确有毎害作用。

在抗崭育种中，利用毒索进行抗性籀选时的关 憊问题是确定毎素使用的浓度与处理方法。如果毒 索浓度过高•则材料死亡率大•选择时易导致一些抗 性材料丢失（如果浓度过低•选择压力小，又不易选 出髙抗材料。赵晓明等⑺报道•用早疫病粗毒素筛选 番茄抗早疫病突变体时.30 %毒索浓度为最佳筛选 浓度.刘进平等⑴在用辣椒疫需培养滤液体外筛选 胡械抗瘟病无性系时•选择粗毒索浓度为50 %作为 选择剂压力上限，筛选出了抗瘟病胡椒再生植株。吴 志凤等:⑷认为•在组织培养中选择存活率为5 %时 的毒亲浓度较为合适。本试验以辣椒疫病粗毒索对 愈伤组织的毒害作用为基础•结合辣锻疫病粗侮素 生物活性测定•综合评定认为•粗帝素合适的筛选诙 度为体积分数60%. 在筛选过程中，愈伤组织的存活率会随若筛选 次数的增加和秦索浓度的增加而减少。为了在后期 能获得较多的存活愈伤组织再生植株•本试脸接种 了大址外植体■这在一定程度上增加了试验成本。本 试验中•在存活愈伤组织很少的悄况下•为了进一步 鉴定其抗病性•从存活的愈伤组织上切取部分愈伤 组织扩大再繁殖•取得了良好的效果。

此外，对筛选出的抗性愈伤组织进行抗性稳定 性鉴定也是非箴必婴的。一方面是由于在一定的选 择压力下，有部分连续筛选多次的愈伤组织细胞仅 仅是生理适应的细胞•而非遗传变异细胞•当其转入 正常培养基并培养数代后，其抗性就会随之消失。另 外愈伤组织通常从复杂的多细胞类型的外植体上诱 导产生，因而其初始生理和遗传具有不一致性；愈伤 组织内部的生理特性可使一些细胞为邻近细胞所缓 冲•从而逃脱选择压：另一方面是由于内部的敏感细 胞可能被抗性细胞所包围•在体外选择中存活下来. 并产生不具抗性的柏［株•其至有可能在敏感细胞和 抗性细胞间通过胞间连丝传递某联具有抗性作用的 化合物，这些表型聆敲作用增加了体外选择的复杂 性。虽然在一定程度上可通过连续转接克服这些峽 点•但对愈伤组织进行抗性稳定性鉴定•则有助于进 一步确定筛选得到的愈伤组织为抗性细胞系・本研 究将筛选得到的抗辣椒疫病细胞变异系在无海素培 养基上继代4次后•转接到含有体积分数60 %粗於 素的筛选培养墓上发现•抗性愈伤组织仍有一定的 生长故•而对照的生长则完全受到抑制•这说明经粗 扇素连续筛选得到的抗性细胞系对辣椒疫病病原菌 粗福索具有稔定的抗性。

总之•利用植物体细胞突变系进行抗性育种•缩 短了仃种年限•并可广泛获得具各种不同优艮性状 的突变系：F1前在体细胞突变体筛选和利用方面•国 内外已经展开了广泛研究•并有一批具有优良性状 的品种（系〉应用于杂交育种和生产之中，随着细胞 工稈研究的深入•利用组织培养的方法诱发变异•筛 选突变体•无论在理论和实践上都具有广阔的師晟 和深远的意义°。

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