反相高效液相色谱法测定附子中乌头碱等3种成分的含量

作者：邓雅琼，刘荣华，邵峰，卢锋。

【摘要】 　　目的测定附子中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量。方法采用反相高效液相色谱（PR—HPLC）法，使用UltimateTM XB—C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流动相为乙腈—0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值为7.29）；检测波长：230 nm；流速1.0 ml·min—1；柱温为35℃。结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的回归方程分别为：Y=31.258X+5.794，r=0.999 9；Y=17.418X+5.236 9，r=0.999 8；Y=18.989X+6.186 6，r=0.999 7。三者的线性范围分别为：3.3125～106μg/ml；0.735 7～23.541 9μg/ml；1.966 1～62.916 4μg/ml。结论该方法简便、准确、分离效果好、灵敏度高,可用于附子的质量控制。

【关键词】 附子 反相高效液相色谱 乌头碱 新乌头碱 次乌头碱。

Abstract：ObjectiveTo develop a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of three principal alkaloids in aconite root. Methods（4.6mm×250mm, 5μm）column by isocratic elution using Acetonitrile —0.2%Glacial acetic acid（adjusted to pH 7.29 with concentrated ammonia）.ResultsThe average recovery of the three alkaloids were analyzed simultaneously with UltimateTM XB—C18 rates obtained were in the range of 98.93—100.5% for RSD below 2.0%.The linear ranges of aconitine; hypaconitine; mesaconitine were respectively 3.312 5～106 μg/ml, 0.7357～23.5419 μg/ml,1.9661～62.9164μg/ml (r=0.999 9, r=0.999 8, r=0.999 7).ConclusionThe contents of alkaloids in aconite root varied significantly from species; hence quality control of aconite root is very necessary.

Key words：Aconite root; RP—HPLC; Aconitine; Hypaconitine; Mesaconitine 　　附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品［1］。附子性大热，味辛、甘，有毒，具回阳救逆，补火助阳，散寒止痛等功效，具有强心、降压、抗炎和镇痛等作用。附子中生物碱主要有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱为剧毒化合物，附子经过炮制后，其生物碱的含量下降，为控制药物的毒性，检测附子中双酯型生物碱的含量是非常必要的。 　　附子生品有大毒，其中所含的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯类生物碱既是有效成分，又是毒性成分，且治疗量与中毒量接近，经加工炮制后此类成分可转化为单酯型生物碱，从而减小毒性 。附子的毒性与炮制方法有关，炮制不及，则可中毒；炮制太过，则不能保证药效［2］。目前并没有能够同时控制毒性和保证疗效的炮制工艺规范，也不能够表明附子安全性和有效性的科学、量化的质量标准，造成各地附子炮制品的质量相差很大。为此本研究建立了灵敏准确的检测方法，对附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱进行了定量分析，为有效地评价和控制附子炮制品质量，规范炮制工艺提供科学依据。

1 仪器与试剂。

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪，G1314B VWD检测器，Agilent chmstation工作站；Sartorius分析天平，KQ—250VDB型双频数控超声清洗器。

1.2 试剂 乌头碱(110720—200410)、新乌头碱(110799—200404)、次乌头碱(110798—200404)对照品购自中国药品生物制品检定所，水为双蒸水(实验室自制)，乙腈(HPLC级，Tedia，美国)，甲醇(HPLC级，Tedia，美国)，附子药材为四川布拖GAP种植基地购买（由江西中医学院生药组褚小兰老师鉴定），其他试剂为分析纯。

2 方法。

2.1 混合对照品溶液的配制分别精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品1.59，1.13，1.51 mg，置于10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度线，摇匀，即得对照品储备液。

2.2 供试品溶液的配制取不同产地的黑附片适量，粉碎，过筛。分别取黑附片粉末5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%氨水5 ml，湿润0.5 h，再加入乙醚50 ml，超声提取10 min，密塞，放置过夜，过滤，再以5 ml乙醚分3次洗涤药渣，过滤，合并滤液，室温挥干，乙腈溶解残渣，用0.45 μm微孔滤膜过滤，定容至2 ml，摇匀，作为样品溶液。

2.3 色谱条件 UltimateTM XB—C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈—0.2%冰醋酸（氨水调pH为7.29），过0.45 μm滤膜；检测波长：230 nm；流速：1.0ml·min—1；柱温35℃。

2.4 测定方法 在选定的色谱条件下，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，按外标法计算各生物碱的含量。