普罗布考对冠状动脉球囊损伤后管壁原癌基因c—myc表达的影响
[摘要]目的：通过建立猪冠状动脉球囊损伤模型，观察普罗布考对血管内膜增生及管壁原癌基因c—myc表达的影响。
方法：选用雌性NewYorkshire良种猪19头，随机分为两组，对照组11头，普罗布考组8头，均行冠状动脉球囊扩张术，术后喂饲6周，重复冠状动脉造影后处死动物。
常规病理制片，观察形态学变化，采用RT—PCR的方法检测c—mycmRNA的表达强度。
结果:对照组损伤动脉内膜可见大量平滑肌细胞增生，呈偏心性增厚，普罗布考组内膜增厚程度明显减低。
对照组c—mycmRNA相对表达强度（2.73±0.51）明显高于正常动脉（0.82±0.09，P0.05），普罗布考组c—mycmRNA相对表达强度（1.44±0.25）较对照组减弱（P0.05），但仍高于正常动脉（P0.05）。
结论:普罗布考具有抑制冠状动脉球囊损伤后c—myc表达和内膜增生的作用。
[关键词]普罗布考；经皮经腔冠状动脉成形术；c—myc基因 Effectsofprobucolontheexpressionofc—mycmRNAandneointimalhyperplasiaaftercoronaryangioplastyinaswinemodel YUExin1,PANQi—xing1,LIJi—fu1,ZHANGWei1,TIANFeng—zheng2,LIUChun—sheng1,MADao—xin1,LIGui—shuang1,CHENYu—guo1,YUAi—qin3,MAYu—lin3,YANGKai3 (1DepartmentofCardiology,theQiLuHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China;2TheQiLupharmaceuticalfactory,Jinan250000,China;3TheZichuanhospital,Zibo255000,China) [Abstract]Objective:Toobservetheeffectofprobucolontheexpressionofc—mycmRNAandneointimalhyperplasiaaftercoronaryangioplastyinaswinemodel.Methods:19femaleNewYorkshirepigswererandomlyassignedtoreceive2g.d—1ofprobucolorcontroltherapyfor4weeksbeforepercutaneoustransluminalcoronaryangioplasty(PTCA),thenPTCAwasunderwentinallthepigs,Probucolwascontinueduntilfollow—upangiography6weeksafterPTCA.Thentheanimalswerekilledandtakenhistopathologicexamination.RT—PCRmethodwasusedtodetecttheexpressionofc—mycmRNAintheinjuredarteries.Results:Theinjuredarteryofthecontrolgrouphadeccentrichyperplasticneointimaandtheexpressionofthec—mycmRNA(2.730.51)washigherthanthenormalartery(0.820.09,P0.05),Theinjuredarteryoftheprobucolgrouphadlesshyperplasticneointimaandlowerexpressionofthec—mycmRNA(1.440.25)thanthecontrolgroup(P0.05),buthigherthanthenormalartery(P0.05).Conclusion:Probucolcandecreasetheexpressionofc—mycmRNAandtheneointimalhyperplasiaafterPTCA. [Keywords]Probucol；Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty；C—mycgenes, 近年的研究表明抗氧化剂普罗布考（probucol,丙丁酚）具有抑制经皮经腔冠状动脉成形术(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA)后再狭窄的作用[1]，但机制尚不清楚。
本实验建立猪冠状动脉球囊损伤模型,观察普罗布考对损伤血管壁内原癌基因c—myc表达的影响，为其防治再狭窄提供依据。
材料与方法 1主要材料与试剂 普罗布考由齐鲁制药厂提供，批号951205；RNA提取试剂盒、PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司生产；RT—PCR试剂均购自美国Promega公司。
2动物模型的制备 健康雌性NewYorkshire良种猪19只,体重（64±5）kg，随机分为对照组(n=11)和普罗布考组(n=8)。
普罗布考组于术前4周开始给予普罗布考1g，bid，至实验结束。
所有动物均于局麻下分离右侧股动脉,在X线透视下将8FJR大腔引导导管插入左或右冠状动脉开口处,行冠状动脉造影,选用3.5～4mm的球囊置于左冠状动脉前降支中段,回旋支中段或右冠状动脉中远段,于8～10个大气压下扩张30s,放气1min,重复2或3次,球囊与管腔直径比约为1.1：1～1.3：1,重复冠状动脉造影,使管腔保持通畅。
术后结扎股动脉,缝合伤口。
普通饲料喂养6周,重复行冠状动脉造影,静脉注射过量戊巴比妥钠处死动物。
迅速取出心脏,分离冠状动脉,根据造影结果切取损伤段血管,选取一部分置10%中性福尔马林中固定,常规染色观察形态学变化；剩余部分封入1.5mL冻存管，置液氮中保存。
3损伤动脉壁内原癌基因c—mycmRNA的检测 采用RT—PCR（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）方法。
3．1动脉壁组织RNA的提取参照试剂盒说明书进行。
3．2cDNA的合成取提取的RNA10μL，冰上依次加入OligodT(0.5μg.μL—1)0.2μL,dNTP(10mmol.L—1)2.5μL,M—MLV逆转录酶（200u.μL—1）0.5μL,RT缓冲液(5×)4μL,RNA酶抑制剂(40u.μL—1)0.5μL,加DEPC(1%焦碳酸二乙酯)处理的三蒸水将总体积补至20μL。
37℃水浴30min,95℃放置10min以灭活M—MLV,0℃放置5min。
置于—20℃备用。
3.3PCR产物扩增C—myc和GAPDH（3—磷酸甘油醛脱氢酶）的引物序列及扩增片段[2]如表1所示。
取0.2mL离心管，以逆转录产物5μL为模板，分别加入上游引物（50mmol?L—1）0.5μL，下游引物(50mmol?L—1)0.5μL，dNTP(10mmol?L—1)1μL，TaqDNA聚合酶(5u?μL—1)0.5μL，PCR缓冲液(10×)5μL，MgCl2(25mmol?L—1)5μL，加三蒸水将总体积补至50μL。
加入液体石蜡50μL，短暂离心混匀，放入PCR仪，95℃变性5min,然后按下述条件扩增35个循环：94℃45s,55℃45s,72℃45s，最后72℃延伸5min。
表1引物序列及扩增片段 引物 引物序列 扩增片段 c—myc上游5＇CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG3＇下游5＇AATTGTGCTGGTGCGTGGAC5＇398bp GAPDH上游5＇CATCACCATCTTCCAGGAGCG3＇下游5＇TGACCTTGCCCACAGCCTTG3＇443bp 3.4PCR产物的鉴定及定量分析取PCR扩增产物10μL，与2μL上样缓冲液（6×）混匀，在2%琼脂糖凝胶中以5V.cm—1的电压电泳2h，紫外透射仪下观察，出现特异性条带为阳性。
采用复日FR—980A生物电泳图像分析系统进行琼脂糖凝胶的扫描和扩增条带光密度分析。
因为GAPDH在组织中稳定表达[2]，所以以GAPDH作为内参照，并按照下列公式计算c—myc的相对表达强度：被测基因表达强度=被测基因光密度/GAPDH光密度。