白莲腐败病病原菌的分离鉴定
打开图片集 摘 要莲腐败病是白莲种植区发生普遍、害严重病害。
该病原分离物培养基上气生菌丝由白色渐变成深紫色并产生两种孢子。
型分生孢子镰刀形无色稍呈弯曲两端尖细（39～55）μ×（8～6）μ多3隔膜少部分～隔或～5隔；型分生孢子椭圆形无色无隔膜（50～9）μ×（0～35）μ。
关键词莲腐败病；尖孢镰刀菌莲专化型；鉴定图分类365 献标识码 编00357（03）800903白莲（lb r Gr）是种水生济作物我国分布很广南北都有种植。
改革开放特别是近些年我国子莲产业发展迅速。
据统计全国子莲种植面积0万以上是我国种植面积水生作物。
莲腐败病是莲种植区发生普遍、害严重病害生长期和莲藕贮藏期可发病分布广阔全国各莲区有发生[]。
莲腐败病属土传病害病菌往往造成藕鞭、藕节、藕根腐烂地上部分叶、花也会萎蔫黄枯发病严重整株枯死[]。
江西白莲主产区每年有30%～70%莲发生莲腐败病0%～5%严重发生莲腐败病颗粒无收莲农损失惨重。
目前对该病害致病机理、病害发生流行规律及有效防治措施等鲜有报道病害防治带了较困难。
试验以广昌发病白莲材结合传统植物病原鉴定方法和分子生物学技术对该病害病原菌进行了鉴定。
材与方法 病菌分离鉴定0年7月从江西省广昌县采集具有型白莲腐败病症状病株参照刘国安[]方法取病株莲鞭、节和须根进行病菌分离马铃薯蔗糖琼脂培养基（）平板上8℃明暗 交替培养；待菌落生长取先端菌丝进步纯化。
观察菌落形态、分生孢子产生及其形态和。
致病性测定将纯化病菌B液体培养基培养制成06孢子菌悬液针刺接种到莲籽育出 生健康莲藕和莲鞭上莲藕保湿 栽回灭菌土莲鞭8℃光照培养箱保湿；以无菌水对照接种[3]。
3 提取将分离致病性测定病原菌采用液体培养基8℃ 0 r培养8 滤收集菌丝将菌丝移至灭菌研钵用液氮将菌丝迅速研磨成粉末。
采用B法提取总[]。
区段扩增分析利用通用引物 （5"GGGGGGG3"） （5"GGG3"）以总 模板进行扩增[]。
R反应体系0×R Br 5 ？滋L0 lL 05 ？滋L（0 l） 05 ？滋L（0 l）05 ？滋L补足5 ？滋L。
反应程序9℃ 3 ；9℃ 30 5℃ 35 7℃ 30 循环；7℃ 5 ；6℃保存。
取R产物各8 ？滋L06%琼脂糖凝胶加5% Glv染液缓冲液00 V稳压电泳50 用凝胶成像系统分析结[5]。
根据L000 rkr标准核酸对应条带位置推断提取出分子量围。
将回收R产物连接至8体上化肠杆菌09感受态利用菌落R筛选阳性克隆送至上海英潍捷基贸易有限公司测序。
5 性比对及系统发育分析测序结与GBk 数据库已知序列进行BL比对确定与试验菌株亲缘关系近种属。
从GBk数据库获得相关种属区序列利用G 0软件[6]构建系统发育进化树确定分离菌株分类地位。
序列对排用LL X83 rgr[7]进化树构建用gbrg方法。
进化树分支模式稳定性用QB和 rgr进行br分析重复次数 000计算各分支置信[8]。
结与分析 病原菌形态鉴定对引起广昌白莲腐败病病原物进行分离并进行形态鉴定。
病原物培养基上气生菌丝早期白色随变成深紫色明暗交替培养0 产生两种孢子。
型分生孢子镰刀形无色稍弯曲两端尖细（39～55）μ×（8～6）μ多3隔膜少部分～隔或～5隔；型分生孢子椭圆形无色无隔膜（50～9）μ×（0～35）μ；厚垣孢子球形顶生或生单胞直径5～5 μ。
致病性测定结莲鞭接种 针眼处便有菌丝生长0 将莲鞭沿针眼处纵截面切开可见接种变褐腐烂（图）；对照不发病。
莲藕接种然条件下60 可见型病状（图B）。
3 区R扩增采用通用引物 和 对其致病性较强6菌株（、、、3、3和3）区r进行R扩增5%琼脂糖凝胶电泳检测并与标准分子量比较结显示出现条长约500 b扩增条带（图）条带特异性。
区域性比对采用通用引物对6菌株区r进行R扩增对扩增产物进行克隆测序获得500 b扩增产物。
将获得序列与GBk数据库已报道序列进行Bl分析6菌株与已知尖孢镰刀菌莲专化型（台湾）r xr lbl xr r和 xr r性高987%～993%。
5 系统发育学分析将6菌株区序列与性较高相关种区构建系统发育树（图3）结表明从莲上分离6菌株与尖孢镰刀菌莲专化型（Q00550）及尖孢镰刀菌其他专化型聚起构成分支支持95%进步证明广昌白莲腐败病病原菌尖镰孢菌莲专化型。
3 结论与讨论尖孢镰刀菌形态鉴定重要特征是孢子形状、以及隔膜数而孢子产生要定培养和相应诱导条件这形态鉴定带了定困难。
我们也直摸便利分子检测鉴定方法r 区受到选择压力较进化速率较快。
绝多数真核生物表现出极广泛序列多态性已成种探科、属、种系统亲缘关系及其物种鉴别重要分子标记。
利用这片段开展BL比对发现B上登录了量尖孢镰刀菌相应序列长500 b左右涵盖了多寄主专化型。
这些信息对利用该片段开展系统发育分析提供了便利[9]。
该分子标记技术具有快速、准确、微量、灵敏高、程序简单等优现已广泛应用真菌分类鉴定、检测和病害诊断[0]。
研究结下步莲腐败病检测和防治工作开展打下了基础。
参考献[] 葵周红梅王春羚等白莲腐败病发生规律及防控对策探讨[]江西植保03（）85[] 刘安国汪金莲刘光亮等莲腐败病病原镰刀菌分离和鉴定[]江西农业学学报990（）[3] 方达植病研究方法[]北京国农业出版社99867[] Gl k l R rl g l[] rk r 990 353[5] 萨姆布鲁克 拉塞尔 分子克隆实验指南3版[]北京科学出版社007300305[6] r K l l G llr vlr G l （G） r vr 0[] llr Blg vl 007 596 599[7] lk g l ll_X r lxbl rg r ll q lg b ql l l[] l Rr 997 5 876 88[8] 赵国屏生物信息学[]北京科学出版社00937[9] 白树猛田黎序列分析真菌分类鉴定和分子检测应用[]畜牧与饲科学00930（）553[0] 陈剑山郑从序列分析真菌分类鉴定应用[]安徽农业科学00735（3）3 7853 7863 79