艾炷灸对D—半乳糖衰老小鼠大脑组织形态和超微结构的影响
作者：赵利华，韦良玉，王进声，姚平，陈煌。
【摘要】 目的观察艾炷灸对脑组织形态和超微结构的影响。方法将健康3月龄昆明雄性小鼠按随机区组设计分为：造模组、生理组、艾灸1组、艾灸2组、电针组、尼莫地平组6组，每组各12只。另设自然衰老组（16月龄）昆明雄性小鼠12只。造模组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组，连续42 d颈背部皮下注射D－半乳糖造成小鼠衰老模型；生理盐水组连续42 d颈背部皮下注射等量生理盐水，12 d后艾灸1，2组，分别选取小鼠“足三里、悬钟”，“关元、百会”行艾柱灸治疗，电针组取“足三里、悬钟”治疗，尼莫地平组给予尼莫地平灌胃，均为隔日1次，共15次。采用光镜观察脑组织形态学变化和神经元密度，电镜下观察脑组织超微结构。结果①生理组大脑皮层、海马CA3区细胞结构正常。模型组、自然衰老组可见皮层、海马CA3区变薄，大部分神经元变性，胞核与胞浆界限模糊，核固缩，核仁消失。艾灸1，2组、电针组和尼莫地平组仍有不同程度的神经细胞变性，但变性神经细胞数量显著减少。②各组小鼠脑皮质及海马CA3区神经元密度差异有显著性意义（P0.01），模型组、自然衰老组与生理组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组神经元密度比较差异有显著性意义（P0.01），模型组、自然衰老组神经元细胞密度下降。③大脑皮质超微结构，生理组神经细胞结构清晰，胞浆较宽，细胞器丰富，核仁清楚。模型组和自衰组神经元细胞变性，凋亡细胞器减少。其他各治疗组超微结构损伤较模型组和自衰组减轻。结论艾炷灸“足三里、悬钟”，“关元、百会”可减轻D—半乳糖造成的氧化损伤，保护脑组织形态及其神经元细胞超微结构。
随着年龄的增长，大脑神经细胞数量减少，突起萎缩，大脑为首的中枢神经系统会出现健忘、反应迟钝、动作不协调等脑萎缩症状，甚至丧失社会活动能力、生活不能自理的老年痴呆的证候。祖国医学称为“髓海不足”。《灵枢·海论》早有明确记载：“髓海有余，则轻劲多力，自过其度”,“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”清代汪昂的《本草备要》亦述：“人之记性均在脑中，小儿善忘者，脑未满也，老年健忘者，脑渐空也。”历代医家都重视艾炷灸防治疾病，延年益寿，故有“保健灸”“长寿灸”之说。目前临床研究证实针灸对脑萎缩、老年性痴呆等有较好的疗效［1，2］。本文从大脑组织形态和超微结构的变化探讨艾炷灸延缓脑衰老的作用机制。
1 材料与仪器。
1.1 动物健康3月龄昆明雄性小鼠。体质量（30±2）g，80只。另购置老年前期（16月龄）昆明雄性小鼠12只。均由广西医科大学动物中心SPF实验室提供（动物许可证号：SCXK桂2003—0003）。
1.2 艾灸用品精制艾绒为苏州东方艾绒厂提供。
1.3 仪器和试剂奥林巴斯生物显微摄影系统（BX60 PM20 型，日本）；全自动轮转式组织切片机（HM355S 型，MICROM德国）；Matic Images Advanced 3.2病理图文分析系统(Motic China Group Co.,Ltd.)；JEM100CX—II透射电镜。D—半乳糖为国药集团化学试剂有限公司提供；尼莫地平片为山西亚宝药业集团股份有限公司提供；0.9%生理盐水为广西中医学院一附院制剂室提供； 4%多聚甲醛、戊二醛（上海国药集团化学试剂有限公司）；1%锇酸、丙酮、环氧树脂812+815、醋酸铀、枸橼酸铅（北京大学医学部病理学系制备）。
2 方法。
2.1 动物分组用Morris水迷宫筛选游泳距离不低于2 600 cm/2 min、体质量不低于28 g的72只健康雄性小鼠。按随机区组设计将72只小鼠分为：造模组、生理组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组6组，每组各12只。16月龄昆明雄性小鼠12只为自然衰老组（简称自衰组）。
2.2 造模方法参照文献［3］用D—半乳糖颈背部皮下注射，建立亚急性衰老小鼠模型。将D—半乳糖试剂与生理盐水按1.2（g）：100（ml）混匀为（12 mg/ml），造模组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组每天以D－半乳糖按120 mg/kg/d颈背部皮下注射（相当于每10 g体重注射0.1 ml浓度为1.2%的D－半乳糖溶液），连续42 d，同时对生理组颈背部皮下注射等量的生理盐水42 d。
2.3 治疗方法造模第13天开始治疗,艾灸1组选取小鼠“足三里、悬钟”，艾灸2组选用“百会、关元”进行艾柱灸治疗，时间选择上午9:00～11:30，选取小鼠双侧“足三里”（先灸）、“悬钟”（后灸），及“百会”（先灸）、“关元”（后灸），灸后用棉签轻轻按压穴位。每次3壮/穴。定位取穴按照《实验针灸学》［4］和《实验动物针灸手册》［5］，“足三里”在膝关节下方，腓骨小头下3 mm处的肌沟中；“悬钟”在后肢外踝尖直上5 mm腓骨后缘处,“百会”在顶骨正中处，“关元”脐下正中线1 cm处。穴位选定后剪毛，施灸时涂凡士林以保护小鼠皮肤且便于固定艾炷，艾炷做得紧而结实(底座直径2 mm，高度5 mm,重量约13～15 mg)，用线香点燃，每壮时间约18～20 s，当小鼠挣扎时更换艾炷。电针组将输出电流正极接足三里，负极接悬钟，用20Hz连续波，电流0.24～0.3 Am以小鼠肢体轻微抖动，不嘶叫为度，3 min/次。尼莫地平灌胃组剂量按体表面积等效折算计算法，予12 mg/(kg·d)，灌胃。治疗方法均为隔天1次，共15次。生理组和造模组、自衰组不做任何治疗性干预，但给予与各治疗组同样时间、同等程度的绑缚刺激。
2.4 样本制备将小鼠断头处死，于冰浴上取左侧大脑额叶皮质处组织2～3 mm3投入3%戊二醛固定3 h以上，送检。剩余的于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。所有组织蜡块4 μm连续切片4张置60℃烤箱烤干。另取自衰组（相当人60岁）［6］小鼠6只，断头处死，标本处理同前述。
2.5 指标检测HE染色，光镜下观察形态学变化并摄片。采用Matic Images Advanced 3.2病理图文系统分析，在显微镜下于每张病理切片皮层和海马两个部位，分别选取不相重叠的12～6个视野，计数完整的神经细胞数，其与视域参考面积(3 951.316～1 975.66 μm2)的比值(单位面积神经元数)即是神经元密度。
电镜下总体观察大脑皮层神经组织超微结构变化：神经细胞、胶质细胞、髓鞘、轴索及血管病变。
2.6 统计方法统计数据用SPSS 13.0软件包处理，各组完整大脑皮质、海马神经元密度用±s,进行多个样本均数的方差分析以及组间两两比较（LSD检验和SNK—q检验）。统计结果见表1。表1 大脑皮质、海马CA3神经元密度（略）。
与模型组和自然衰老组比较，1)P0.01；与尼莫地平组比较，2)P0.01，3)P0.05；与模型组比较，4)P0.05。