人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

作者：孙守勋, 李强, 刘静, 李玲, 蒲晓允。

【摘要】 目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2（TLR2）胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法: 应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET32a(+)上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经NiNTA亲和层析纯化, 用SDSPAGE和 Western blot进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性。结果: 成功构建了pET32a(+)TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性。结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础。

【关键词】 TLR2; 原核表达; 多克隆抗体; 单个核细胞。

Toll样受体作为细胞表面的模式识别受体, 能够对病原体识别、 结合、 引发一系列信号间的转导, 促进各种炎性介质的释放, 对宿主的天然免疫防御具有重要作用, 目前其家族成员至少有11个［1］。TLR与天然免疫应答关系的研究中, 倍受关注的是TLR2和TLR4。其中TLR2识别的配体最多, 可协助TLR4参与人体内对LPS的反应。在TLR2的结构中其胞外区富含亮氨酸的重复序列, 是配体作用的关键功能区域。我们应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中克隆TLR2胞外区基因, 并利用原核表达体系表达该基因的融合蛋白, 制备多克隆抗体并检测其活性, 为进一步研究TLR2胞外区的功能奠定必要的基础。

1 材料和方法。

1.1 材料 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司, Tripure购自Roche公司; AMV反转录酶、 Taq酶、 T4 DNA连接酶、 限制性内切酶EcoR I和Sal I均为TaKaRa公司产品; 胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购自博大泰克公司; LPS、 IPTG、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为Sigma公司产品; 羊抗兔IgG抗体购自北京中山公司, 原核表达载体pET32a(+), 抗His抗体和NiNTA亲和纯化试剂盒购自Novagen公司, 大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3)由本院中心实验室保存。其余试剂为进口及国产分析纯, 实验用仪器和动物为本院和学校中心实验室及实验动物中心提供。引物合成及DNA测序由上海英骏生物公司完成。

1.2 方法。

1.2.1 人外周血单个核细胞的分离与培养 在本院检验科门诊收集体检患者的静脉血（EDTA抗凝）, 其各项血液指标均正常, 按操作说明用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞, PBS洗涤后培养于RPMI1640培养液中(含100 mL/L胎牛血清, 脂多糖溶液10 g/L, 青霉素10 万U/L)。细胞经脂多糖刺激培养后, 提取RNA。

1.2.2 总RNA的提取 以Tripure分离试剂提取细胞总RNA, 具体步骤按德国Roche公司的Tripure Isolation Reagent操作说明进行。总RNA—70℃保存。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增目的片段 由GenBank下载人TLR2全序列, 并根据原核表达载体pET32a(+)上的多克隆位点采用Primer Premier5.0设计一对TLR2胞外区扩增引物。上游引物为5′GCCGAATTCATGCCACATACTTTGTGGATGGT3′; 下游引物为5′CGGGTCGACTCACATTAAGGGTACAGTCATCAG3′。其中上游引物的5′端引入EcoR I的酶切位点（下划线表示）, 下游引物的5′端引入Sal I的酶切位点（下划线表示）, 内含启动子ATG和终止密码子TCA。以提取的细胞总RNA为模板, 按常规方法建立逆转录反应体系及条件合成cDNA。采用降落PCR(Touchdown PCR, TDPCR )的方法设置反应条件, 按引物的最小Tm值减5度设定温度梯度。反应条件为: 先在94℃变性3 min后, 94℃, 30 s; 62℃, 1 min; 72℃, 1 min; 10个循环, 94℃, 30 s; 60℃, 1 min; 72℃, 1 min; 10个循环, 94℃, 30 s; 57℃, 1 min; 72℃, 1 min; 10个循环, 94℃, 30 s; 55℃, 1 min; 72℃, 1 min; 12个循环, 最后72℃延伸10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物, 切胶纯化回收目的片段。

1.2.4 重组原核表达载体的构建与鉴定 用EcoR I和Sal I分别双酶切纯化回收的目的基因片段和pET32a(+)表达质粒, 经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收后, 用T4DNA连接酶16℃过夜连接载体和目的片段, 得到重组表达载体pET32a(+)TLR2。重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3), 涂布Amp+的LB平板培养过夜, 挑选阳性菌落, 扩增后提取质粒, 双酶切鉴定, 对鉴定正确的质粒将其菌液送公司测序。

1.2.5 重组融合蛋白的诱导表达 将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3), 挑取单克隆接种于Amp+的LB液体培养基中, 37℃过夜培养。次日, 按1∶100的比例接种, 220 r/min, 37℃进一步扩大培养至细菌密度为A600=0.6时, 加入异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmoL/L进行诱导, 25℃继续培养4 h, 同时设含有空载体质粒和未诱导的菌液为阴性对照。离心收集诱导菌, 于2×SDS上样缓冲液中重悬细菌, 100℃煮沸10 min, 12 000 r/min离心5 min, 取上清进行SDSPAGE分析, 具体电泳方法参见文献［2］进行。

1.2.6 重组蛋白的纯化及鉴定 挑取单克隆菌落接种于30 mL的Amp+的LB液体培养基中, 摇床中37℃过夜培养, 按前述同样的方法诱导重组蛋白的表达并收集菌液, 4℃、 5 000 g离心15 min, 弃上清后用预冷的PBS洗涤2次, 加入溶菌酶至终浓度10 mg/L, 室温消化后置冰浴中超声破碎细菌, 将经过超声裂解处理后的细菌裂解液用NiNTA亲和纯化试剂盒纯化回收目的蛋白, 具体操作按Novagen公司产品说明书进行。收集过柱洗脱液, 用SDSPAGE检查纯化效果, Western blot检测目的融合蛋白。

1.2.7 抗血清的制备 用纯化的TLR2融合蛋白以500 μg/(只·次)免疫新西兰白兔, 初次免疫与福氏完全佐剂混合乳化后, 于背部皮下多点注射。以后每隔10 d加入等量的福氏不完全佐剂加强免疫共3次, 于第4次免疫1周后采血, 分离血清, 得到的多克隆抗体于4℃保存。

1.2.8 抗体的效价及特异性检测 将纯化的融合蛋白以10 mg/L的浓度包被至酶标板, 每孔50 μL, 待测抗血清倍比稀释后, 采用ELISA方法检测, 酶标仪测定A495的吸光度值为指标, 检测抗体效价。以纯化的蛋白为抗原, 制备的血清为一抗（1∶2 000稀释）, HRP标记的羊抗兔IgG为二抗（1∶2 000稀释）, 按常规方法利用Western blot检测抗体的特异性。

2 结果。

2.1 人外周血单个核细胞总RNA的提取 提取出的总RNA经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 可以看到两条清晰的条带, 分别为28 S和18 S, 且约为2∶1, 表明获得较好的总RNA（图1）。

图1 人外周血单个核细胞总RNA的电泳图谱。

2.2 TLR2胞外区目的基因的扩增 通过从人外周血单个核细胞中提取总RNA, 应用RTPCR技术, 利用特异性引物扩增目的基因。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示, 扩增产物大小约为1 000 bp左右, 同预期目的片段的大小符合（图2）。