大鼠急性坏死性胰腺炎时P物质在肠壁上的表达及其与肠黏膜通透性
［摘要］目的: 了解急性坏死性胰腺炎（ANP）时大鼠回肠组织中P物质的表达及其与肠黏膜通透性的关系。 方法: 健康成年SD大鼠随机分为对照组40只和ANP组40只，对照组开腹后只翻动胰腺，ANP组大鼠胰胆管恒速逆行注射5%牛黄胆酸钠制成ANP大鼠模型，分别于制模成功后8、12、16和20h处死大鼠采取标本。用同位素法测定肠黏膜通透性，免疫组织化学方法检测P物质在回肠组织中的表达水平和组织学定位。 结果: ANP组大鼠回肠组织中P物质的表达以及肠黏膜通透性（99m Tc—DT—PA排泄率）较对照组明显增加（P0.05）。P物质在回肠组织中的表达与肠黏膜通透性呈明显正相关（r=0.66，P0.01）。 结论: ANP时大鼠回肠组织中P物质表达升高，且随时间延长而增加，其表达与大鼠肠黏膜通透性呈正相关。
［关键词］ 急性坏死性胰腺炎;神经激肽.1受体;P物质;肠黏膜通透性;大鼠 急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）起病急，病情凶险，当合并胰腺及胰周感染时，病情更加复杂，死亡率明显增加。临床上急性胰腺炎死亡的病人中80%是由胰腺坏死组织继发感染所致。肠源性因素在急性胰腺炎继发感染中的作用和重要性已被认识并确立，因此，探讨ANP时肠黏膜通透性的发生机制对防治胰腺感染有重要意义。
急性胰腺炎时，炎症介质的产生和释放以及炎症细胞的聚集在病程中起重要作用。目前明确的前炎症或促炎症细胞因子较多，其中P物质及其受体―――神经激肽.1受体（NK.1R）近年来受到高度重视［1］ 。但P物质在ANP回肠组织中的表达尚不清楚，P物质与肠黏膜通透性之间的关系也未阐明。本实验通过制作ANP大鼠模型，应用免疫组织化学法研究ANP时P物质在回肠中的表达和组织学定位，进而探讨P物质与肠黏膜通透性之间的关系。
1 材料和方法 1.1 实验动物及分组。
健康成年SD大鼠80只，体重250～280g，雌雄各半，由东南大学医学院实验动物中心提供，随机分为对照组和ANP组各40只。
1.2 主要试剂及配制 浓缩型兔抗大鼠P物质抗血清、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），血清淀粉酶（AMS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），牛磺胆酸钠（Sigma公司），亚锡喷替酸（DT—PA）（中国原子能科学研究院同位素所），锝（99m Tc）（中国核动力研究设计院第一研究所）。称取牛磺胆酸钠2g溶入40ml生理盐水（NS）中，制成5%牛磺胆酸钠溶液，在超净台内用过滤器（滤孔为0.22nm）过滤溶液除菌，分装于2只无菌瓶中，常温避光保存备用。
99m Tc.DTPA制备:用灭菌NS淋洗钼.锝发生器获得99m Tc淋洗液，放射活度仪测定其放射活度，灭菌NS将其稀释成放射活度为100μCi・ml—1 ，DTPA标记。
1.3 实验方法及步骤 1.3.1 模型制作。
实验前大鼠禁食12～16h，自由饮水。大鼠称重，3%戊巴比妥钠0.1ml・（100g）—1 腹腔注射麻醉。妥善固定大鼠，切开腹壁进入腹腔。近肝门处用无损伤小动脉夹夹闭胆总管，于胆胰管入十二指肠处对侧缘，用连接微量注射泵的4.5号针头斜行刺入十二指肠壁，并进入胰管0.3cm处，以恒定速度（0.1ml・min—1 ）注入5%牛磺胆酸钠［0.1ml・（100g） —1 ］。并于近端空肠内缓慢注入100μCi99m Tc—DTPA。关腹后向大鼠背部皮下注入NS4～6ml。 对照组仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，而不注射牛磺胆酸钠。 1.3.2 标本采取。
距原切口1.0cm切开腹壁，观察腹腔内大体病变情况。 无菌抽取下腔静脉血2～3ml，放入离心管中以3000r・min—1 离心10min，取上清行血清淀粉酶测定（碘.淀粉比色法）。切取2cm长末段回肠，用10%甲醛固定，4℃保存，并收集大鼠8、12、16和20h尿液。
选用分子直径11nm的99m Tc—DTPA为探针，测定尿液中同位素脉冲数，以间接反映肠黏膜通透性。
99m Tc.DTPA为水溶性，无毒，在体内不代谢，通过尿液测定，具有敏感、准确、简单的优点。计算公式:肠黏膜通透性（%）=99m Tc.DTPA排泄率（%）=（尿液测定值—本底测定值）×总尿量药物测定值—本底测定值 ×100%。
于近端空肠内缓慢注入100μCi99m Tc.DTPA后放入代谢笼，留取大鼠8、12、16和20h尿液，用放射免疫γ计数器测定尿液中99m Tc.DTPA脉冲数。
应用免疫组织化学法分别检测对照组和ANP组回肠组织的P物质表达水平。 操作步骤:石蜡切片脱蜡到水，用3%H2 O2 灭活内源性酶，滴加1∶100稀释的兔抗大鼠多克隆抗体50μl，置室温下1h，PBS漂洗后滴加1∶100稀释的生物素化山羊抗兔IgG50μl，置室温下30min，PBS洗5min×2次，再滴加1∶100稀释的SABC50μl，用DAB显色，自来水冲洗终止反应。苏木素轻度复染，自来水冲洗，二甲苯透明，封片。染色阳性呈棕褐色。阴性对照组仅滴加正常山羊血清（其中不含一抗）以排除假阳性，其余步骤同前。
显微图像分析:使用四川大学图像图形研究所研制的BioMas图像处理系统随机采集图像，自动得出阳性染色区的面积并除以视场面积，即染色面积比。 1.4 统计学处理 用SPSS软件对数据进行统计学分析，计量资料采用t检验，各组数据以ˉx±s表示，用Spearman相关性分析法进行结果之间相关性分析，P0.05被认为两组间有显著差异。