免疫组化PV二步法与SP三步法比较
作者：黄秀娟 张喜 邓昊 刘丽江 镇鸿燕。
【摘要】 目的:用两种不同的免疫组化方法二步法和三步法分别在胃癌组织中进行ERα—36染色结果的比较，寻求不同免疫组化原理的染色试剂盒对实验结果的影响。方法： 利用两种不同的试剂盒研究相同的胃癌微阵列芯片（共352点，以肝组织作为定位标志），通过比较两种免疫组化方法在相同组织上表达的不同做比较。结果： 三步法制片结果比二步法背景低，阳性率低，非特异性着色小，结果明确易读；而二步法较三步法操作简单，检查阳性率高，阳性强度高。结论： 针对一抗为ERα—36的免疫组化染色，三步法虽然实验耗时比较长，但实验结果较好，明确易读，适合科学研究。二步法较易出结果，灵敏度较高，阳性强度高，较易出背景着色，假阳性率高，故不适于科学研究，但因为操作方便，检出阳性率较三步法高，对于ERα—36弱表达的病例不容易漏诊，且能较快出结果，故可考虑在临床病理诊断中选择应用。
【关键词】 免疫组化技术; 二步法; 三步法； 组织芯片技术。
免疫组织化学技术是利用已知的特异性抗体与抗原的特异性结合来检测组织或细胞内某种物质的性质，并利用酶作用于底物所产生的颜色反应来显示某种物质的分布于细胞内定位的一种技术，自建立免疫酶标技术以来，这门技术得到了迅速发展，在科研和临床诊断已被广泛应用。研究发现部分胃癌为雌激素受体依赖性［1］。但一张好的免疫组化切片需要真阳性染色结果表达在预期对应的组织细胞中，定位清晰准确，间质清楚,无或少背景着色［2］。影响免疫组化的结果有很多，如组织固定、脱水的过程、修复的好坏以及免疫组化的过程和免疫组化试剂盒的选取以及显色步骤均对结果有影响［3］。目前研究影响免疫组化结果的因素多从免疫组化试剂盒以外几方面分析，对不同原理的试剂盒对实验结果的影响研究甚少。本研究拟以ERα—36为目的指标，观察免疫组化两步法和三步法在ERα—36检测中的异同，探讨两种方法在使用中的优缺点。
1 材料和方法。
1.1 材料。
由江汉大学肿瘤教研室构建352点胃癌组织芯片，以正常肝组织作为定位标记，芯片直径0.6㎜，片厚4ｕm。
ERα—36兔抗人多克隆抗体，由Creighton大学王兆一教授提供，以胞浆着色为阳性。三步法SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，二步法PV—9000试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.2 方法。
选用已知阳性的正常乳腺组织为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，染色步骤严格按说明书进行。苏木素复染核。
以三步法为例，具体操作如下：
① 石蜡切片常规脱蜡至水化，用PBS（pH 7.4）冲洗3次，每次3min；。
② 用EDTA缓冲液浸泡(pH 8.0),高压修复2min，使抗原暴露；。
③ 每张切片加150μl过氧化酶阻断溶液（试剂A），室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3min；。
④ 除去PBS液，每张切片加150μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10min；。
⑥ PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每张切片加150μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10min， PBS冲洗3次，每次3min；。
⑦ 除去PBS液，每张切片加150μl链霉菌抗生物素—过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min；。
⑧ 除去PBS液，每张切片加600μl的新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～10min；。
⑨自来水冲洗，苏木素复染 ，自来水冲洗返蓝或冲洗后用PBS快速返蓝；。
⑩ 梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
两步法④至⑦步骤与三步法不同，不用正常血清封闭，直接滴加一抗过夜，然后直接滴加聚合了辣根过氧化物酶的特异性二抗，余步骤相同。