胃癌组织中E26转录因子1表达与血管生成的相关性研究

作者：丁印鲁 宫向前 李霞 傅勤烨 张建良 李兆亭。

【摘要】目的：研究胃癌组织中E26转录因子1（Ets1）表达与血管生成的关系。方法：应用免疫组织化学方法（SP法）检测86例胃癌标本中Ets1的表达及微血管密度（MVD）；建立裸鼠胃癌皮下种植瘤模型，分别应用Ets1反义，正义寡核苷酸与PBS行瘤内注射，应用逆转录聚合酶链式反应检测瘤组织Ets1mRNA的变化，并检测瘤组织Ets1蛋白及微血管密度的差异。结果：胃癌组织中Ets1标记指数（LI）和MVD呈正相关（γ=0.495,P＜0.05）；经Ets1反义寡核苷酸治疗后，裸鼠瘤组织Ets1mRNA及Ets1蛋白表达降低，反义组MVD显著低于正义组与PBS组（10.4±3.1 VS 24.5±8.4,20.6±7.5,P＜0.01）。结论：胃癌组织中Ets1在促进血管生成中起重要作用。

【关键词】胃肿瘤・转录因子・寡脱氧核苷酸类，反义・新生血管化，病理性。

Correlation of Ets1 expression and angiogenesis in gastric cancer。

【ABSTRACT】Objective:To investigate the relationship of the expression of Ets1 and angiogenesis of gastric cancinoma.Methods:Expression of Ets1 and microvessel density(MVD)was detected immunohistochemically in paraffin imbedded specimens of 86 cases of gastric cancinoma.Human gastric carcinoma transplanted subcutaneously in nude mice model was constructed,and subquently the mice were devided into three groups:control group,sense oligoxydeonucleotide(sODN)group and antisense oligoxydeonucleotide(AsODN) group:After treatment respectively,changes of Ets1mRNA of transplanted tumor were detected by the reverse transcription polymerase chain reaction method(RTPCR),Ets1 protein and MVD was examined immunohistochemically.Results:A positive correlation was found between the expression of Ets1 and MVD in human gastric carcinoma tissues.Ets1 AsODN could underregulate the expression of Ets1mRNA and Ets1 protein.MVD of AsODN group was signicantly lower than control group and sODN group(P＜0.01).Conclusion:Ets1 may promote angiogenesis of gastric cancinoma.

【KEY WORDS】Stomach neoplasms・Transcription factors・Oligoxydeonucleotide,antisense・Neovascularization,pathologic。

肿瘤的侵袭转移需要广泛的血管生成，而血管生成依赖于血管生成促进因子及抑制因子的调节。E26转录因子1（E26 transformationspecific1,Ets1）能够调节很多肿瘤基质降解与血管生成基因的转录，为此我们研究了胃癌组织中Ets1表达对血管生成的影响。

1 材料与方法。

1.1 临床资料 1996年7月~1999年12月山东大学齐鲁医院普通外科手术切除的86例胃癌标本，均经手术后病理证实。所有病人术前均未接受化疗、放疗或者其它针对肿瘤的治疗。男54例，女32例，年龄28~68岁，平均年龄（52.5±10.4）岁。

1.2 寡核苷酸链的人工合成 Ets1反义寡核苷酸（antisense oligoxydeonucleotide,AsODN）序列为5’AGATCGACGGCCGCCTTCAT3’，正义寡核苷酸（sense oligoxydeonucleotide,sODN）序列为5’ATGAAGGCGGCCGTCGAACT3’，经Genebank同源性检测，未发现与人类其它基因序列有同源性。AsODN以及sODN序列由上海生工合成，均为部分硫代磷酸型，PAGE纯化，冻干分装，—20℃保存，应用时以无菌双蒸水溶解。

1.3 细胞培养及裸鼠胃癌皮下种植瘤抑制试验 胃癌细胞株SGC7901培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，内含青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml；单层培养于37℃、5%CO2饱和温度培养箱中。0.25%胰蛋白酶消化，取处于对数生长期的未经寡核苷酸处理的SGC7901细胞，制成浓度为1×107个/ml细胞悬液。

取裸鼠12只，于每只右后肢腋部皮下接种细胞悬液0.2ml。皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准。成瘤后随机分为：（1）对照组：每日于瘤内多点注射0.2ml/只的生理盐水；（2）sODN组：同法注射Ets1 sODN，100μg(0.2ml)/只；（3）AsODN组：同法注射Ets1AsODN，100μg/只。每天观察裸鼠的生长情况，注射后12d断颈处死裸鼠，部分瘤组织于—70℃保存，部分应用福尔马林固定。

1.4 逆转录聚合酶链式反应（RTPCR） 取100mg裸鼠肿瘤组织，Trizol试剂盒提取总RNA，DEPC处理，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。反转录：总体积50μl,1μgRNA,100℃变性5min，冰浴2min,MMLV RT 5×buffer 4μl,25mmol/L硫酸镁1μl ，10mmol/L dNTP1μl,Oligo(dt)0.1μg,RNase抑制剂20U，MMLV逆转录酶400U，加无核酸水至50μl，37℃逆转录1h，95℃变性10min，4℃保存。Ets1上游引物5’GGGTGACGACTTCTTGTTTG3’，下游引物5’GTTAATGGAGTCAACCCAGC3’，βactin上游引物5’TCCTCCCTGGAGAAGACTA3’，下游引物5’AGTACTTGCGCTCAGGAGGA3’，扩增片段长度分别为274bp、313bp。PCR反应体系：Taq DNA聚合酶10×buffer 5μl,25mmol/L氯化镁3μl，上下游引物各10pmol,10mmol/L dNTP1μl,反转录产物3μl，Taq DNA聚合酶3U，加双蒸水至50μl。反应条件：94℃变性60s，57℃复性60s，72℃延长90s,共28个循环后，取RTPCR产物20μl加入2%的琼脂糖中（含少量溴化乙锭），电泳，分析结果。

1.5 免疫组织化学 采用链霉菌生物素――过氧化物酶法（SP法）。CD34鼠抗人单克隆抗体（即用型，克隆号QBEnd/10）、Ets1兔抗人多克隆抗体（克隆号sc350）为SantaCruz公司产品，工作浓度为1∶500。SP超敏试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物技术开发公司。

Ets1蛋白阳性染色定位于细胞核和/或细胞浆，呈棕黄色或深黄色。随机记数4个视野（×400）下共400个细胞，计算平均每个视野下的阳性细胞数目，以Ets1蛋白标记指数（labelling indices,LI）表示［1］。Ets1 LI=阳性细胞数目/计数的细胞总数×100%。

MVD的计数采用如下方法：先在100倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域，再于200镜下计数MVD；任何黄染的细胞或细胞簇，即使未显示管状结构都计算为一个MVD值［2］。

1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0 for windows中的多组样本均数的比较（LSD法），直线相关分析，P＜0.05差异有统计学意义。