农杆菌介导的旱稻遗传转化的策略研讨
旱稻，也被称作陆稻，是水稻的变异型。
其耐旱性强，适于旱地、坡地等干旱生态环境下种植。
其在形态、生理等方面与水稻有不少的差别，一般在干旱缺水的生长状况下表现明显。
据统计，每生产500 kg旱稻稻谷，用水量则仅为水稻用水量的10%～20%。
缺水是我国农业生产所面临的严峻考验之一[1]。
此外，我国水资源时空分布不均匀，南方水资源较为充沛，而北方水资源不到全国总量的20%。
特别是进入7月中下旬，大部分地区降雨开始明显减少，而水稻此时处于抽穗灌浆的关键时期，用水需求量很大，同时现有选育和推广的稻作品种普遍抗旱性不足，致使很多地区缺水的现状已成为影响水稻产量的重要原因之一。
因此大力推广适于旱地种植的栽培稻即旱稻栽培种，能节约大量的农业用水，充分利用土地资源，降低生产成本，提高经济效益[2]。
此外，旱稻采用直播种植的方式，省去了育秧、插秧等环节，大大减轻稻农的田间劳动量，非常适用于目前国内农业劳动力短缺的现状。
大力发展旱稻还可为培育优质稻类新品种打下基础，而其关键是进行品种选育，获得抗逆、优质、高产的旱稻品种。
通过农杆菌介导法这一基因工程手段进行改良是稻类作物遗传转化的首选方式[3—8]。
近年来，针对稻类作物遗传转化体系的研究绝大多数是以水稻为研究材料，而关于旱稻的研究报道则主要集中在杂交育种、抗旱性测定、生理指标测定、特定基因的标记定位、遗传多样性分析等方面[9，10]。
由于两者品种间的明显遗传差距，在愈伤组织诱导、抗性筛选、分化再生等方面的具体培养条件差别较大[11—13]。
目前已报道的旱稻遗传效率较低，且不同品种间转化条件差别较大。
本研究以高耐旱、大穗大粒型粳旱稻品种鲲旱1号的成熟种子为材料，研究农杆菌介导法转化旱稻的体系中各个关键技术环节，为建立稳定高效的旱稻转化体系，进一步获得具有抗逆性强的高产优质转基因旱稻奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 旱稻材料 旱稻品种鲲旱1号成熟胚诱导的胚性愈伤组织为受体材料。
1.1.2 质粒及菌株 pCAMBIA3301由中国农业科学院生物技术研究所提供。
随后将来自于掌叶半夏的凝集素基因PPA构建入该表达载体，赋予转基因旱稻抗虫的能力。
筛选标记基因为bar（Biolaphos resistance gene），编码膦丝菌素乙酰转移酶（Phosphinothricin acetyl transferase，PAT），可对除草剂草丁膦的有效成分膦丝菌素（PPT）产生抗性。
农杆菌菌株为AGL—1，由中国农业科学院生物技术研究所提供。
1.1.3 培养基 研究采用NB培养基（N6大量元素、B5微量元素、有机元素、铁盐）及MS培养基作为基本培养基，添加一定浓度的激素及适量谷氨酰胺、水解酪蛋白和麦芽糖等成分。
具体培养基成分见表1。
1.2 方法 1.2.1 种子的灭菌 选取适量子粒饱满、干净无霉变的旱稻种子，脱去颖壳，放置在指形管中，先用清水洗两遍，在超净台中加入适量75%的乙醇振荡消毒1 min，然后弃去液体，再加入适量的0.1%升汞或者有效氯为5%的次氯酸钠溶液和几滴吐温20。
灭菌两次，每次20 min，期间不断振荡。
随后弃去液体，用无菌水清洗5次，在三角瓶中浸泡20～30 min，再用无菌水清洗3～5次。
1.2.2 愈伤组织的诱导及继代 待种子基本干燥之后，用灭菌的小勺或镊子将种子均匀分布在不同成分的诱导培养基上，每一个培养皿放置15～20粒，用封口膜将培养皿封好，置于28 ℃培养箱中暗培养。
培养3～4 d后可见愈伤组织明显形成，培养至7～10 d时，愈伤组织长至绿豆粒大小，此时将长出的芽切去，再继续培养20～22 d统计出愈率。
诱导愈伤暗培养约30 d左右，挑选颜色淡黄、质地致密，并且愈伤组织表面散落出直径约1～2 mm的球形愈伤团块，将其继代到新鲜诱导培养基上，于28 ℃暗培养5～7 d。
1.2.3 侵染及共培养 取适量超低温保存的带有目的基因的农杆菌菌种涂布在YEP固体培养基上，28 ℃下暗培养48 h。
将培养基表面长出的农杆菌轻轻刮下放入50 mL AAM液体培养基中，于28 ℃，200 r/min振荡培养2～3 h。
在继代培养基中挑选出直径为2～3 mm的状态良好、松脆圆润的愈伤组织，放入灭菌锥形瓶中，每个锥形瓶大约收集300块。
在摇瓶培养后的菌液中逐渐加入新的AAM培养基，调整OD600 nm为0.2～0.3，将菌液倒入收集好愈伤组织的锥形瓶中，室温侵染20 min，期间不时轻摇。
弃去菌液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干，转移至铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，25 ℃暗培养3 d。
1.2.4 抗性愈伤的筛选 将共培养后的愈伤组织取出置于灭菌培养瓶中，用无菌水洗涤4～5次，每次充分摇动，然后加入[(专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]含500 mg/L特美汀的NB液体培养基，室温静置10 min。
弃去液体，倒入含500 mg/L特美汀与2.0 mg/L 2，4—D的NB液体培养基，封口后室温80 r/min摇瓶培养1 h，弃去液体，将愈伤组织置于带有无菌滤纸的培养皿中吸干水分并放置过夜。
再将愈伤组织均匀放置在恢复培养基上，28 ℃暗培养5～7 d（恢复培养基是在NB基本培养基中加入2，4—D 2.0 mg/L）。
将经过转化的愈伤组织转移到筛选培养基上，28 ℃暗培养，15 d后继代一次，继续筛选培养15—20 d。
1.2.5 预分化及分化 将经过筛选后新长出的抗性愈伤组织转接到预分化培养基上，28 ℃暗培养5～7 d。
随后将其转入分化培养基，28 ℃暗培养3 d后移至光下，28 ℃培养15 d后挑选新生的幼小嫩芽移至新的分化培养基，继续培养15 d左右。
1.2.6 壮苗及生根 待新生幼苗长至2 cm左右时，移至生根培养基中，28 ℃光照培养3～4周，待诱导出根并且幼苗长至7～10 cm时，从培养基中取出，洗净根部沾染的培养基，移至育秧盘中（营养土与蛭石按照3∶1混合），继续培养10 d左右后即可移入温室或大田。
1.2.7 数据分析 出愈率=（产生愈伤组织的种子个数/接种的种子个数）100% 抗性愈伤率=（抗性愈伤数/供试愈伤数）100% 分化率=（再生植株数/抗性愈伤数）100% 再生率=（再生植株数/供试愈伤数）100% 转化率=（阳性转基因苗数/供试愈伤数）100% 1.2.8 转基因旱稻植株的分子水平鉴定 采用CTAB法从抗性再生旱稻幼苗的新鲜叶片中提取基。