N乙酰氨基半乳糖转移酶2对胃癌细胞SGC7901黏附迁移能力的影响
【摘要】 目的： 探讨N乙酰氨基半乳糖转移酶2（Polypeptide：Nacetylgalactosaminytransferases 2，ppGalNAcT2）对胃癌细胞SGC7901黏附迁移的影响。方法： 将ppGalNAcT2正义载体（pEGFPC1T2）、空载体（pEGFPC1）及干扰载体(pSilenCircle)转染SGC7901细胞，采用反转录PCR方法检测其在mRNA水平表达，分别通过细胞黏附实验和穿膜实验检测其黏附力和迁移力变化。结果： 转染正义ppGalNAcT2的SGC7901细胞比转染干扰载体的SGC7901细胞对纤连蛋白、基质胶和透明质酸的黏附能力低，但其侵袭迁移能力没有变化。结论： ppGalNAcT2低表达可能与肿瘤浸润转移具有相关性。
【关键词】 N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAcT2） 胃癌细胞SGC7901 黏附 迁移。
［Abstract］ Objective: To investigate Polypeptide：Nacetylgalactosaminytransferases 2 （ppGalNAcT2）′s role during adhesion and migration of gastric cancer cell SGC7901. Methods： To transfect ppGalNAcT2 plus sense vector（pEGFPC1T2），vacuity vector（pEGFPC1）and interference vector (pSilenCircle)to SGC7901. We detected express level of ppGalNAcT2 by RTPCR and detected the capability change of adhesion and migration by cell adhesion and Transwell essay. Results： Contrast to SGC7901 which interference vector, the one transfected ppGalNAcT2 plus sense vector had low adhesion capability to matrigel, hyaluronic acid and fibronectin, but the same migration capability. Conclusion： It was possible that ppGalNAcT2′s low expression and tumor adhesion and migration had their correlation.
［Key words］ Nacetylgalactosaminytransferases 2； gastric cancer cell SGC7901； adhesion； migration。
N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAcT2)及其家族作为黏蛋白O糖基化的起始酶，可能与肿瘤的黏附和迁移密切相关。肿瘤细胞表面有类似黏蛋白的糖蛋白，含有丰富的O糖基化位点，在肿瘤的转移和浸润生长过程中黏蛋白起着重要的作用。因此，本实验通过转染正义ppGalNAcT2、空载体和干扰载体SGC7901细胞，分别检测这4种亚细胞株对基质胶（matrigel）、透明质酸（HA）和纤连蛋白（FN）的黏附力。用Transwell法检测转染后亚细胞株迁移力的变化，以探讨在细胞水平ppGalNAcT2与胃癌细胞SGC7901黏附迁移的关系。
1 材料与方法。
1.1 材 料。
1.1.1 细胞系 人胃腺癌细胞株SGC7901购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。真核表达载体pEGFPC1由本室保存。
1.1.2 主要试剂 RPMI1640完全培养基（Gibco,美国）；脂质体2000转染试剂盒（Invitrogen公司）；G418选择性抗生素（Roach公司）；Oligo(dT)，TaqDNA多聚酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs),RNA抑制酶（RNase), RNA反转录酶(MMLV)及DNA相对分子质量标准等均购自晶美公司；Transwell 24孔板、基质胶、透明质酸和纤连蛋白购自上海季美公司。
1.2 方 法。
1.2.1 胃癌SGC7901细胞正义真核表达载体、空载体和RNA干扰真核表达载体亚细胞株的构建 干扰技术是遵循RNA干扰目标序列的选取原则，利用互联网资源，对ppGalNAcT2基因mRNA序列设计5条可能性小的干扰RNA（siRNA），并且由PCR方法扩增得到带有RNA pol Ⅲ启动子的siRNA内源表达系统，脂质体介导转染至人胃癌细胞株SGC7901，运用RTPCR方法检测转染后各细胞株ppGalNAcT2 mRNA水平的表达变化，筛选出其中ppGalNAcT2抑制效率最高的siRNA片段；将这段siRNA插入到RNA干扰真核表达载体pSilenCircle中，脂质体介导转染人胃癌细胞株SGC7901,本文在此基础上展开实验。
将构建好的pEGFPC1T2正义真核表达载体、空载体pEGFPC1和RNA干扰真核表达载体pSilenCircle通过脂质体2000转染胃癌SGC7901细胞，G418筛选2个月内的阳性克隆，获得稳定表达和干扰N乙酰氨基半乳糖基转移酶基因的单克隆细胞株。由于干扰真核表达载体上无荧光标记故用蛋白质印迹检测ppGalNAcT2的表达情况，来鉴定干扰载体是否转染成功。
1.2.2 ppGalNAcT2 mRNA 表达的 RTPCR检测 引物序列如下：上游5′AAGAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAA3′，下游5′ATCAAAACCGCCCTTCAAGTCAGCA3′，由上海生工生物工程公司合成。收集生长处于对数期的细胞按Trizol Reagent(Invitrogen公司)操作手册提取总RNA，1%甲醛变性琼脂糖电泳检测RNA完整性。取总RNA 2 μg反转录为 cDNA第1链，再进行PCR扩增。扩增产物以2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，图像分析仪摄像并分析结果。PCR反应体系(50 μl)，反应条件：95℃预变性3 min，95℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，39个循环，72℃延长10 min。
1.2.3 琼脂糖凝胶滴试验 培养皿中细胞长到80%时胰酶消化后用完全培养基重悬。按每100 μl琼脂糖滴中含1×106个细胞和0.3%琼脂糖制备悬液。按每滴 1.5 μl的量种植凝胶滴到6孔板中，用0.5 ml完全培养基覆盖，24 h后将琼脂糖胶滴轻轻取出,倒置显微镜下观察凝胶滴以及边缘细胞，并拍照。
1.2.4 黏附实验 取24孔培养板,每孔分别加入基质胶、透明质酸、纤连蛋白溶液0.2 ml (含20 μg)，置于37℃ CO2培养箱孵育1 h，PBS洗2次，再加入3 %牛血清白蛋白0.2 ml，孵育2 h，PBS洗2遍，包被备用。用无血清PRMI1640液稀释细胞，37℃孵育30 min，其间充分振荡以防细胞凝集。将上述细胞悬液分别接种于已包被的板内, 5×104个细胞(0.5 ml/孔)，于37℃中保温，30，60和90 min时弃去未黏附细胞，用PBS 液轻洗2遍。0.25%胰酶消化后收集黏附细胞计数，黏附百分率=黏附细胞数/总细胞数×100%。
1.2.5 穿膜实验 包被基底膜：用50 mg/L基质胶1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。每孔加入50 μl含10 g/L BSA的无血清培养液，在下室面铺纤连蛋白，将200 μl枪头的尖端剪掉,吸取纤连蛋白均匀涂抹在小室的下面。用无血清培养基培养细胞12～24 h，使细胞处于饥饿状态。收集细胞，用PBS洗1～2遍，台盼蓝染色检测细胞活力达95%以上，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105。取细胞悬液200 μl加入Transwell小室， 24孔板下室加入500 μl含FBS的培养基，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养8～12 h。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，苏木精染色、伊红染色等。细胞计数：把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。取有固定的位置15个视野计数细胞个数。
1.2.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行统计。数据用±s表示，两组计量资料均数比较呈正态分布且方差齐时用t检验，如非正态分布和（或）方差不齐时用秩和检验，P0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果。
2.1 胃癌SGC7901细胞正义和空载体真核表达载体亚细胞株的构建。
带有GFP的正义载体pEGFPC1T2和空载体pEGFPC1成功转入胃癌SGC7901细胞中，可以看到明显绿色荧光（图1）；而没有转染GFP的对照组和干扰组在荧光显微镜下则看不到绿色荧光。
RNA干扰真核表达载体转染细胞后无荧光发出,通过蛋白质印迹检测ppGalNAcT2的表达情况。从图2可以看出，SGC7901干扰组ppGalNacT2的表达比其他组低，同时也证明干扰载体被转染。