黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响

作者：张涛 金英 魏晓东 王明富 王跃新 田丽华。

【摘要】 目的 探讨黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响。方法 选用昆明小鼠，用D半乳糖致成亚急性衰老模型，并观察药物对小鼠呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ的活性及DNA聚合酶γmRNA的表达。通过RTPCR法检测衰老小鼠肝线粒体中DNA 聚合酶γ基因在mRNA水平的变化。结果 黄精多糖可提高衰老小鼠呼吸链酶活性，降低DNA聚合酶γ mRNA的表达。结论 黄精多糖可以通过改善肝线粒体能量代谢，使DNA聚合酶γ mRNA表达减少，提高呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ而起到延缓衰老的作用。

【关键词】 黄精多糖;线粒体;呼吸链复合体;DNA聚合酶γ。

许多研究证明，线粒体DNA(mtDNA)损伤呈增龄性积累，且与生物衰老之间存在高度的相关性〔1，2〕。线粒体氧化损伤程度受到线粒体抗氧化系统及修复系统的监控，其中碱基切除修复在监控线粒体DNA氧化损伤中起主要作用〔3〕。黄精多糖有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、降低血脂血糖、增加机体免疫力等一系列作用。本实验观察黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶和DNA损伤和改善线粒体能量代谢方面提供部分理论依据。

1 资料与方法。

1.1 药品和制剂 黄精多糖购于佳木斯医学院药店，经提取纯化并干燥。D半乳糖(Dgal)(上海试剂二厂);RTPCR试剂盒(大连宝生物公司) 。

1.2 动物 昆明小鼠，2～3月龄，雌雄各半，由佳木斯大学实验动物中心提供。随机分成青年对照组、衰老模型组、衰老模型黄精多糖大剂量组、中剂量组、小剂量组，每组18只。

1.3 方法 衰老模型组及各给药组，每日上午颈背部皮下注射Dgal 100 mg/kg，青年对照组注射等量的生理盐水，连续4 w，造模完成后，第29天开始，模型给药组分别给予黄精多糖400、200、100 mg/kg予以灌胃，青年组、衰老组灌服等量的温开水，连续4 w。第56天末次给药前禁食12 h，给药1 h后颈椎脱臼处死，打开腹腔迅速取肝组织。

1.4 样品制备。

1.4.1 制备10%肝组织匀浆 取肝脏0.5 g左右，在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干称重，加入9倍体积预冷的匀浆介质，用电动匀浆机充分磨碎得组织匀浆。

1.4.2 制备线粒体 取10%的肝组织匀浆，以2 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液以10 000 r/min高速冷冻离心机离心15 min，沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体悬浮于冰冷的匀浆介质中制备成混悬液，反复冻融使线粒体膜破裂，备用。

1.4.3 肝脏总RNA提取 取出的肝组织，用DEPC处理过的生理盐水清洗，锡纸包好，放入液氮中冻存。在液氮中研磨50～100 mg放入1 ml Trizol内剧烈震荡，静置5 min，加氯仿200 μl，震荡15 s，4℃ 静置2.0～3.0 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液置于EP管中，加异丙醇500 μl，4℃ 静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，用75%的乙醇1 ml洗沉淀，4℃离心7 500 r/min 5 min，弃上清，自然干燥。制成RNA溶液以分光光度法进行定量，测光密度A260/A280比值。采用甲醛变性电泳检测RNA完整性。

1.4.4 PCR引物〔4〕 DNA聚合酶γ上游5′TCAAGGAAGTCACGATGG3′;下游5′AGGCACTGGTCAATGTCTAC3′，预计扩增片段470 bp。GAPDH上游5′GGAGTTGCTGTTGAAGTCG3′;下游5′GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3′，预计扩增片段599 bp。

1.4.5 RTPCR 参照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV) Ver 3.0介绍的方法。混匀后置于30℃ 10 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min合成cDNA。PCR反应体系反应条件94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。

1.4.6 电泳与凝胶成像 取4 μl PCR扩增产物、2 μl上样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶水平电泳上做产物检测分析，电压80 V，电泳1.5 h，EB 染色，经YLN2000凝胶成像分析系统照相分析，用DNA聚合酶γ mRNA产物的OD值与GAPDH mRNA 产物的OD值作为DNA聚合酶γ产物的相对含量。