β射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的影响
作者：谷欣权 曹霞 孔祥波 马庆杰。
【摘要】 目的 探讨β射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的影响。方法 20例前列腺增生(BPH)患者随机分为4组：对照组未行内照射，3组照射组于前列腺切除术前1，4，7 d行90Sr/90Yβ射线内照射，采用TUNEL染色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测前列腺细胞凋亡变化。结果 与对照组比较，β射线内照射后前列腺细胞凋亡增多，并随时间延长而增加（P＜0.01），对照组基因组DNA保持完整，β射线辐射7 d后基因组DNA呈现梯状带凋亡改变。结论 β射线内照射能够有效诱发人增生的前列腺细胞凋亡，进而引起前列腺组织萎缩。
【Abstract】 Objective To investigate the effect of β irradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatic tissues. Methods 20 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) were divided into 4 groups according to the different time treated with 90Sr/90Y β irradiation to prostatic hyperplasia applicator before prostatectomy or TURP. The cell apoptosis of human hyperplastic prostatic tissues was detected by TUNEL and flow cytometry and agarose gel electrophoresis.Results Compared with control group, the percentage of cell apoptosis arose after treated with 90Sr/90Y β irradiation and grew more with time going (P＜0.01). DNA kept complete in control group while typical DNA ladder band appeared in DNA fragment electrophoresis and the positive cells that presented browed were observed in β irradiation 7 group. Conclusions βrays irradiation can efficiently induce cell apoptosis from human prostatic hyperplasia tissue and cause the atrophy of prostatic tissue.
【Key words】 Benign prostatic hyperplasia；Radiation；Apoptosis。
细胞凋亡在前列腺增生（BPH）的发生、发展中具有关键性作用〔1，2〕。电离辐射作为一种基因毒素，除了可使前列腺组织中与细胞凋亡相关的基因和细胞因子发生改变外，还能直接或间接引起DNA损伤而诱发凋亡〔3，4〕。本实验采用TUNEL染色、流式细胞术（FCM）和琼脂糖凝胶电泳检测β射线内照射对增生前列腺细胞凋亡的影响，为采用电离辐射治疗BPH提供实验依据。
1 材料与方法。
1.1 实验分组 BPH患者20例，年龄58～72岁，病程2～13年，患者随机分为4组，每组5例：3个照射组于前列腺切除术前1，4，7 d行90Sr/90Yβ射线内照射，照射剂量为30～50 Gy，对照组未行内照射。各组均行经尿道前列腺切除术或经膀胱前列腺摘除术获得前列腺标本。
1.2 TUNEL染色检测细胞凋亡 4%多聚甲醛固定前列腺组织4～6 h，石蜡包埋。切片加蛋白酶K 37℃消化5 min，TBS洗涤。加含有TdT和DIGdUTP的标记液20 μl/片，37℃标记2 h，TBS洗涤2 min×3次。加封闭液50 μl/片室温30 min，加封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体50 μl/片，37℃反应30 min，TBS洗涤。加SABC 37℃反应60 min，TBS洗涤。DAB显色15 min，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。显微镜下凋亡阳性细胞核呈深浅不一的棕黄色，正常细胞核呈蓝色，在每张切片上随机选取10个高倍镜视野，计阳性细胞数和细胞总数，计算阳性反应细胞数占细胞总数的平均百分比。
1.3 FCM检测凋亡细胞DNA含量 新鲜组织研磨成单细胞，70%冷乙醇固定，4℃过夜。600 r/min离心5 min，弃上清，加0.01 mol/L PBS 5 ml，混匀1 500 r/min离心，弃上清，反复3次。用PBS调整细胞浓度106/ml，过350目滤网，制成单细胞悬液，加入浓度200 μg/ml的RNase A，37℃水浴30 min，加入低渗荧光染料溶液混匀，4℃避光染色30 min。用流式细胞仪摄取PI荧光，测凋亡细胞核百分率。
1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 组织研碎后，离心去上清，加入10倍体积的DNA抽提液混匀，37℃水浴1 h，加入蛋白酶K，50℃水浴3 h，12 000 r/min离心5 min，用饱和苯酚抽提上清1次，再用苯酚/氯仿/异丙醇（25∶24∶1）1ml充分混匀，8 500 r/min离心5 min，弃酚相，保留上清，上清中加入3 mol/L醋酸钠和冷乙醇，—20℃沉淀过夜。—10℃ 12 000 r/min离心10 min，将沉淀溶于20 μl TE缓冲液，加入1 μl RNA酶，37℃保温1 h。加4 μl样本缓冲液到含有0.4 μg/ml溴化乙锭的1%～2%的琼脂糖凝胶的样品孔中，室温、恒流75 mA，于1×TAE缓冲液中电泳1～2 h，紫外灯下观察实验结果。
1.5 统计学处理 数据应用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。
2 结 果。
2.1 TUNEL法染色检测前列腺细胞凋亡 对照组仅见少数散在的凋亡细胞，经90Sr/90Yβ射线辐射后细胞凋亡增多，并随时间而逐渐增加。与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡更加明显，见图1。
2.2 FCM检测凋亡细胞DNA含量 经流式细胞仪分析凋亡细胞的DNA含量，可见对照组凋亡细胞百分率为（1.74±0.35）%，β射线辐射可使前列腺组织细胞周期时相发生改变，在二倍体峰前出现亚二倍体峰即凋亡峰。随时间延长凋亡细胞逐渐增多，辐射1、4、7 d凋亡细胞百分率分别为(3.83±0.74)%，(5.66±1.72)%，(13.15±3.03)%，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。
2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 对照组基因组DNA保持完整，经β射线辐射7 d后基因组DNA发生断裂，呈现典型的凋亡改变即DNA梯形带（DNA Ladder），表明β射线可使细胞核内DNA在核小体连接处发生断裂，形成180～200 bp及其整数倍的核苷酸片段，见图2。