NT3基因逆转录病毒表达载体的构建

作者：董智勇, 李忱, 陈东 孟晓婷, 陈雷, 路来金。

【摘要】 目的: 分离大鼠神经营养素3（NT3）基因, 构建pLEGFPNT3逆转录病毒表达载体。方法: 利用RTPCR技术钓取大鼠NT3基因, 克隆到测序载体pMD18T中, 测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFPC1中, 通过Lipofectamine 2000导入包装细胞PA317。结果: RTPCR产物为776 bp, 经测序鉴定虽与GenBank中NT3基因的序列相差1个碱基, 但不影响NT3蛋白质的表达; 构建的pLEGFPNT3重组载体经酶切鉴定, 证实NT3基因片段正确插入pLEGFPC1载体中。转染包装细胞后, 激光共聚焦显微镜下观察导入NT3基因的PA317细胞发绿色荧光。结论: 分离得到了大鼠NT3基因成功构建了pLEGFPNT3表达载体。

【关键词】 神经营养素3; 逆转录病毒载体; 重组。

神经干细胞（neural stem cells, NSC）的应用为脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的治疗带来新的希望, 而NSC移植治疗SCI的效果直接与移植细胞在损伤局部的存活、 功能性分化以及再生轴突能否与靶器官重建突触联系密切相关, 这三者主要是由损伤局部的微环境所决定的［1］。如何改善损伤微环境使其更有利于NSC的存活分化以修复SCI, 神经营养因子（neurotrophins, NTF）起着至关重要的作用。神经营养素3（neurotrophin3, NT3）是在脊髓中作用最强的NTF, 它可以明显促进皮质脊髓束的再生和NSC的迁移与轴突生长［2］; NT3 能特异地提高出生后大鼠发育中皮质脊髓束侧枝发芽, 支配它的靶组织［3］。SCI后NT3 mRNA与蛋白质的表达与损伤前相比均有所提高, 说明受损脊髓对NT3内源性需求增加［4］。通过转基因技术, 可使含有NTF基因的神经干细胞（neural stem cells, NSC）不断分泌所需营养因子, 促使神经再生和功能恢复。本实验目的是利用RTPCR技术分离获得大鼠NT3基因, 并通过携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的逆转录病毒载体构建NT3基因的表达载体, 为进一步将NT3基因导入NSC内, 探讨应用转NT3神经干细胞治疗脊髓损伤的研究提供参考。

1 材料和方法。

1.1 材料 dNTP、 DNA maker、 PCR产物回收试剂盒购自鼎国生物试剂公司; Tag plus DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自Promega公司; Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性内切酶、 pMD18T 载体购自TaKaRa公司; Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司; G418购自Gibco公司; Polybrene购自Sigma公司; pLEGFPC1购自BD公司; PCR引物由联星公司合成; PA317细胞购自第四军医大学实验动物中心。

1.2 方法。

1.2.1 NT3基因的调取、 扩增、 测序 根据GenBank中大鼠NT3的基因序列(GenBank 登录号为M34643), 设计2条引物, 并加入2个酶切位点Hind III（AAGCTT）、 BamH I(GGATCC)和保护碱基: 5′CGCGAAGCTTGCATGTCCATCTTGTTTTATGTG3′; 5′GCCGGGATCCTCATGTTCTTCCGATTTTTCTTG3′; 扩增产物大小为776 bp。从出生2～3 d的大鼠脑纹状体中提取组织总RNA, 应用RTPCR法扩增NT3基因片段, 回收DNA与pMD18T 载体连接, 转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 氨苄平板筛选后扩增重组质粒pMD18TNT3, 并进行小量提取, 测序。

1.2.2 表达NT3的逆转录病毒载体的构建 提取质粒pGEMTNT3和pLEGFPC1, 分别用Hind III与BamH I进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳回收NT3与 pLEGFPC1片段, 将NT3用T4 DNA连接酶与pLEGFPC1载体进行连接, 连接子转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 转化细菌涂布LB氨苄平板筛选阳性重组质粒, 挑取单菌落接种于2 mL LB培养液中, 37℃震荡培养过夜, 小提质粒, 用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切鉴定出重组质粒, 然后大量制备重组质粒pLEGFPC1NT3, —20℃备用。

1.2.3 逆转录病毒载体的包装和筛选 pLEGFPC1逆转录病毒载体中保留了病毒的包装信号以及介导病毒整合、 具有启动子和加工功能的2个LTR。将其导入病毒包装细胞系PA317进行包装可以产生具有感染能力的复制缺陷型重组病毒颗粒。按照Lipofectamine2000转染试剂盒提供的方法转染操作。转染前1 d以3×108/L将PA317细胞接种于6孔培养板, 以无抗生素的生长培养液培养。转染前汇合达90%~95%。次日以无血清培养液洗2次。溶解DNA于100 μL无血清培养液中, 轻柔混合; 溶解Lipofectamine于100 μL无血清培养液中, 室温静置5 min; 二者混合后放置20 min。向6孔板中加入200 μL混合物, 前后轻摇混匀。6 h后更换生长培养液。24 h后, 以1/10传代并在含0.5 g/L G418选择培养基筛选培养; 48 h后, 更换为0.4 g/L G418选择培养基继续培养, 隔日换液直至克隆出现。挑取上述克隆进行培养扩增, 并继续用0.4 g/L G418选择培养基筛选, 稳定传代。

2 结果。

2.1 大鼠NT3全长cDNA的克隆 从出生2~3 d大鼠纹状体组织中提取总RNA, RTPCR扩增出NT3全长cDNA, 以10 g/L琼脂糖凝胶电泳（图1）。PCR产物连入pMD18T载体后, 测序。将所得测序结果与GenBank登录号为M34643的序列进行比较, 虽然第67个碱基由G突变为A, 如下面序列中黑体下划线部分所示: 1 GGGCCCGACG 11 TCGCATGCTC 21 CCGGCCGCCA 31 TGGCCGCGGG 41 ATTCGCGAAG 51 CTTGCATGTC 61CATCTTATTT 71 TATGTGATAT 81 TTCTTGCTTA 91 TCTCCGTGGC 。但UUA与UUG编码同一氨基酸亮氨酸（Leu）, 不影响蛋白质的表达。

2.2 pLEGFP NT3重组载体的构建 用Hind III与BamH I进行双酶切, 得到776 bp的片段, 证明重组载体构建成功。酶切鉴定见图2, 将重组载体命名为 pLEGFPNT3。

2.3 pLEGFPNT3在PA317细胞中的表达 用重组表达质粒转染PA317细胞48 h, 于共聚焦显微镜下观察, 可见部分细胞发出绿色荧光, 证明已有pLEGFP NT3质粒转入PA317细胞内(图3)。图3 共聚焦激光显微镜下转染的PA3 17细胞发出绿色荧光。

3 讨论。

NTF 是能支持神经元存活, 促进其生长、 分化及维持其功能的一类因子。NT3是在1990年利用NGF与BDNF序列同源性被发现的NTF, NT3 与NGF、 BDNF一样出现在胚胎神经系统发生的时候。SCI后NT3 mRNA与NT3的表达与损伤前相比均有所提高, 说明受损脊髓对NT3内源性需求增加。NT3是在脊髓中作用最强的NTF, 它可以明显促进皮质脊髓束(corticospinal tract , CST)的再生和神经元的存活、 迁移与轴突生长。体外研究表明, NT3 可维持交感、 感觉、 基底前脑胆碱能和运动神经元的存活, 能在体外上调胆碱能神经元乙酰胆碱转移酶的表达, 支持中脑多巴胺能神经元分化, 以及促进发育和损伤的CST侧枝出芽［4, 5］。由于NT3 不能透过血脑屏障, 只能局部给药, 而在损伤局部持续给药必须通过反复室管膜内注射或借助于侵袭性微管装置, 实际应用极不方便。有研究证明, 通过转基因技术, 可使含有神经营养作用基因的细胞不断分泌所需营养因子, 促使神经再生和功能恢复。Kim等［6］将NGF和BDNF基因转入成纤维细胞中, 将其移植到挫伤的大鼠脊髓中, 结果表明能促进大鼠运动功能的恢复。Bllts等［7］将NT3基因通过腺病毒转入肋间神经, 然后将其移植到大鼠脊髓半横断处, 移植后16周与对照组相比下行的皮质脊髓神经纤维增加了3～4倍, 同时后肢的运动功能也得以恢复。但将NT3基因导入NSC后移植治疗脊髓损伤的研究少见报道。为了探讨其可行性, 本研究组拟将NT3基因导入NSC, 并将转NT3基因的NSC移植到脊髓损伤的相应脊髓节段, 观察实验动物上肢功能恢复情况。本实验选用转染效率较高的逆转录病毒载体pLEGFPC1作为表达载体, 并利用EGFP作为报告基因, 这为进一步探讨转NT3基因的NSC治疗脊髓损伤的可行性提供参考。

【参考文献】 ［1］ Lucia RV, Patrizia C, Giovanna P, et al. Influence of local environment on the differentiation of neural stem cells engrafted onto the injured spinal cord［J］. Neurological Research, 2006, 28(5): 488—492.［2］ Houweling DA, Lankhorst AJ, Gispen WH, et al. Collagen containing NT3 attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery［J］. Exp Neurol, 1998, 153(1): 49—59.［3］ 蔡文琴, 李海标. 发育神经生物学［M］. 北京: 科学出版社, 1999: 259—279.［4］ Joho Tokumine, Osamu Kakinohana, Dasa Cizkova, et al. Changes in spinal GDNF, BDNF, and NT3 expression after transient spinal cord ischemia in the rat［J］. Neuroscience Research, 2003, 74(4): 552—561.［5］ Hamada Y, Ikata T, Katoh S, et al. Effects of exogenous transforming growth factorbeta 1 on SCI in rats［J］. Neurosci Lett, 1996, 203(2): 97—100.［6］ Kim DH, Grin PH, Noble LJ, et al. Treatment with genetically engineered fibroblasts producing NGF or BDNF can accelerate recovery from trauntic spinal cord injury in the adult rat［J］. Neuroreport, 1996, 7(13): 2221—2225.

［7］ Blits B, Dijkhuizen PA, Boer G, et al. Intercostal nerve implants transduced with an adenoviral vector encoding neurotrophin3 promote regrowth of injured rat corticospinal tract fibers and improve hindlimb function［J］. Exp Neurol, 2000, 164(1): 25—37.