高效液相色谱法测定万寿菊花萃取物中的叶黄素含量
作者：李高峰 王佩维 聂永亮 宋 鹏。
【摘要】 目的用高效液相色谱法对万寿菊花萃取物中所含的叶黄素含量进行分析测定。方法首先由万寿菊花萃取物制备出叶黄素单体，使用色谱柱为Diamonsil C18柱；流动相为甲醇—乙腈—醋酸乙酯—水（30∶29∶40∶1）; 流速0.75 ml· min—1; 检测波长450 nm; 柱温25 ℃; 进样量20 μl。结果该方法最低检出限量1×10—7g·ml— 1 ,叶黄素在0.8～24 μg·ml— 1范围内线性关系良好，方法精密度RSD（相对标准偏差） 为0.96% ,加标回收率为99. 49 %～100. 22% ,RSD 为 0.82%～1.64 %。结论该方法简便、准确、重复性好。
叶黄素(Lutein)，又名“植物黄体素”，是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中的天然抗氧化剂。叶黄素高活性、富含电子的长多烯碳链，能保护人体免受单线态氧和自由基的作用而带来的伤害［1］，而且叶黄素是人体血液中主要的类胡萝卜素之一，能够抑制肿瘤生长，可以预防因机体衰老而引发的心血管硬化、冠心病［2，3］；叶黄素能够很好地保护皮肤免受阳光灼伤，减少人体所受来自于电脑屏幕、电视屏幕等的辐射和超量紫外线照射的损害［4］，具有明显的防辐射、护肤、润肤和抗衰老作用。另外，叶黄素和玉米黄质是眼睛中仅有的两种类胡萝卜素，预防老年性眼球视网膜黄斑区病变引起的视力下降与失明［5］、白内障等眼部疾病［6］是叶黄素的独特的功能。此外，叶黄素还是一种很好的天然着色剂，在饲料中添加叶黄素不仅可以给动物补充营养，还可以提高动物肉质和蛋的品质，因此，叶黄素被广泛应用于医药、保健品、化妆品、食品着色、烟草、水产品及动物饲料［1］。在国际市场上，1 g叶黄素的价格与1 g黄金相当，所以人们把它称为“植物黄金”。万寿菊花花瓣中叶黄素是最主要的类胡萝卜素，通常还有3%～6%的玉米黄质,其它类胡萝卜素的含量很小，因此是非常好的叶黄素来源。从万寿菊花中提取叶黄素已经成为国内外研究的热点，所以建立科学、稳定、可靠的分析方法非常必要。目前,分析检测叶黄素的主要方法有：紫外— 可见分光光度法、色谱法、质谱、液质联用、核磁共振等，HPLC可以实现对待测物中叶黄素的定性定量分析［7，8］。本实验主要研究了由万寿菊萃取物制备的叶黄素的高效液相色谱分析方法。
1 仪器与试剂。
LC5500 高效液相色谱仪, 北京东西电子技术研究所；ESJ120 — 4 型电子天平，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；ME211 型超声波清洗器，美国Metter Electronics 公司； Millipore 膜过滤器及真空泵，美国Waters 公司；紫外可见分光光度计：UV22450 UV—Visible spectrophotometer ；叶黄素样品，由万寿菊干花经超临界CO2萃取制备出浸膏，经皂化、分离和纯化处理制得，所得的叶黄素样品经天然产物标准样品国家核心实验室（北京）分析鉴定含量为97.29%作为标准样品。分析用试剂为分析纯，北京化工厂生产，水为二次蒸馏水。
2 方法。
万寿菊花经超临界CO2萃取得到萃取物，将万寿菊花萃取物在碱性条件下皂化，然后分离出游离叶黄素，经过纯化处理得到叶黄素样品。称取叶黄素样品20.0 mg，用流动相配成8×10—6g·ml— 1 的溶液。
色谱条件: 色谱柱为Diamonsil C18柱；流动相为甲醇—乙腈—醋酸乙酯—水（30∶29∶40∶1）； 流速0.75 ml·min—1；检测波长450 nm; 柱温25 ℃; 进样量20 μl。
3 结果。
3.1 色谱条件的确定试验了不同体积比的甲醇—乙腈、甲醇—乙腈— 醋酸乙酯、甲醇—乙腈—醋酸乙酯— 水为流动相，最终确定流动相为甲醇—乙腈—醋酸乙酯—水（30∶29∶40∶1）； 流速0.75 ml·min—1；分离度、柱压及峰形均较理想，取叶黄素标准样品适量，用流动相溶解, 制成8×10—6g·ml— 1 的溶液，用紫外—可见分光光度计在200～800 nm 的波长范围内扫描（见图1），最大吸收波长为450 nm ，本文选择450 nm 为检测波长。叶黄素样品高效液相色谱图见图2。
3.2 标准曲线的绘制及最低检出限的测定精密称取叶黄素对照品20.00 mg 置50 ml量瓶中, 用流动相溶解并稀释至刻度。精密移取0.1，0.5，1，1.5，2，3 ml置50 ml量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀。在下进样,以叶黄素峰面积A(mv ·s—1) 对进样浓度C (μg ·ml— 1 ) 进行作图得到标准曲线,如图3。从图中可以看出,叶黄素在0.8～24 μg·ml— 1 范围内线性关系良好。利用此线性关系图可以对叶黄素浓度与峰面积做定量分析。