人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达
作者：夏桂枝，张国成，陈新民，洪新如。
【摘要】 目的： 构建人EPO基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人EPO的人脐血间充质干细胞. 方法： 从人胎肝细胞中提取总RNA，经过RTPCR方法扩增人EPO全长cDNA，应用基因重组技术将EPO cDNA基因亚克隆至pcDNA3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3—EPO构建的正确性，再将pcDNA3—EPO经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞，经G418筛选后获得稳定转染EPO基因的人脐血间充质干细胞，用RT—PCR，Western Blot和细胞免疫化学方法鉴定外源人EPO基因在人脐血间充质干细胞中的表达. 结果： 酶切和测序结果均证实pcDNA3—EPO构建正确，RT—PCR，Western blot和细胞免疫化学结果显示转染人EPO基因的人脐血间充质干细胞体外能表达EPO. 结论： 构建成功人EPO基因真核表达载体，转染人脐血间充质干细胞后在体外可获得稳定表达.
【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human EPO gene and explore its expression in mesenchymal stem cells (MSCs) derived from human umbilical cord blood (UCB). METHODS: The total RNA was extracted from human fetal liver cells. EPO cDNA was obtained by RT—PCR amplication and subcloned into pcDNA3 vector to construct recombinant pcDNA3—EPO plasmid. After identified by restriction enzyme analysis and sequencing,the pcDNA3—EPO was introduced into the human UCB—derived MSCs mediated by lipofectamine and the expression of exogenous EPO was examined by RT—PCR,Western blot and immunocytochemistry. RESULTS: The recombinant pcDNA3—EPO was shown to meet the design by restriction enzyme analysis and sequencing. The results of RT—PCR,Western blot and immunocytochemical analyses indicated that the exogenous EPO successfully expressed in human UCB—derived MSCs. CONCLUSION: The recombinant pcDNA3—EPO with full coding sequence of human EPO cDNA is successfully constructed and human UCB—derived MSCs with stable expression of exogenous EPO are established.
【Keywords】 erythropoietin；fetal blood；mesenchymal stem cells; transfection。
0 引言 近年研究发现促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3—4］. 我们构建人EPO基因真核表达载体，将其转染人脐血MSCs，观察EPO在人脐血MSCs中的表达情况，以探索EPO基因修饰的人脐血MSCs用于移植治疗新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic—ischemic encephalopathy，HIE）的可行性.
1 材料和方法。
1.1 材料 人胎肝细胞系L02，质粒pcDNA3由福州总医院实验科王水良博士惠赠. 菌种E. coli DH5α为福州总医院实验科保存. RT—PCR反转录试剂盒（Promega公司）；DNA胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（Qiagen公司）；EcoRⅠ，XhoⅠ限制性内切酶，dNTP，Taq酶，T4 DNA连接酶，DNA分子质量Marker DL2000，DL15000（TaKaRa公司）；LipofectamineTM 2000，Trizol（Invitrogen公司）；MSCs培养基MesencultTM（Stem cell公司）；兔抗人EPO抗体、HRP—羊抗兔IgG，Western Blot化学发光试剂（Santa cruz公司）；PVDF膜（Pierce公司）；EliVisionTM Plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）.
1.2 方法。
1.2.1 EPO cDNA的合成 参照Trizol说明书抽提人胎肝L02细胞总RNA，反转录为人胎肝细胞总cDNA，以反转录产物为模板，PCR法扩增EPO cDNA. PCR引物根据Genbank中登录的EPO cDNA 全长序列设计两对引物. 扩增EPO cDNA全长序列上游引物： 5′—atgaattcatgggggtgcacgaatgtcc—3′，下划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物：5′—gcctcgagtcatctgtcccctgtcctgc—3′，下划线部分为XhoⅠ酶切位点；预期扩增片段长582 bp. RT—PCR法鉴定EPO在人脐血MSCs中表达的上游引物为：5′—tcatctgtgacagccgagtc—3′，下游引物为：5′—cactgacggctttatccaca—3′，预期扩增片段长288 bp. 均由上海生工生物工程公司合成. PCR反应体系如下：总体积为50 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP混合液4 μL，待扩增的模板（人胎肝细胞总cDNA）6 μL，上游引物（20 μmol/L）0.5 μL，下游引物（20 μmol/L）0.5 μL，DNA聚合酶1 μL，dd H2O 33 μL. 94℃预变性5 min，94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环. 72℃延伸5 min. 取反应产物3 μL，15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.2 pcDNA3—EPO表达载体的构建 将PCR法扩增的EPO cDNA和质粒pcDNA3经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段. T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素选择性培养基上筛选阳性克隆. 快速抽提质粒后进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的菌株送上海生工生物工程公司测序. pcDNA3—EPO重组质粒的纯化按质粒抽提纯化试剂盒说明进行.
1.2.3 人脐血MSCs的分离培养 脐血标本来自于健康足月顺产新生儿，产妇产前检查均正常，脐血的收集均已征得产妇同意. 无菌条件下采集脐带血，每份30～80 mL，脐血采集后4 h内应用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞. 所得单个核细胞以1×109/L接种于MesencultTM完全培养基，置于37℃，50 mL/L CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养.5～7 d后首次换液，7～14 d后贴壁的人脐血MSCs细胞克隆出现，当细胞融合达80%左右时按1∶3的比例传代.
1.2.4 pcDNA3—EPO重组质粒稳定转染人脐血MSCs 选择P3代人脐血MSCs，采用脂质体介导转染方法转染EPO基因，按照LipofectamineTM 2000试剂说明书进行. 转染24 h后按1∶10接种到6孔板中，加入新鲜的完全培养基. 次日换液，加入含400 mg/L的G418的筛选培养基培养6 d，再换用含200 mg/L G418培养基培养，2 wk后阳性克隆形成，挑取单个克隆扩大培养和传代.
1.2.5 RT—PCR鉴定 抽提稳定转染pcDNA3—EPO的人脐血MSCs总RNA，经无RNA酶的DNA酶处理并抽提纯化后反转录为总cDNA，以总cDNA为模板，采用EPO鉴定引物，PCR扩增EPO cDNA基因片段. PCR反应体系同上方法.
1.2.6 Western Blot 鉴定 取生长良好的稳定转染pcDNA3—EPO的人脐血MSCs 1×107，加入RIPA缓冲液（含10 g/L PMSF），冰浴后4 ℃离心取上清，用同样方法从培养的胎肝细胞系L02中抽提蛋白质. 测定蛋白浓度后进行100 g/L SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳完毕后将蛋白转移至PVDF膜上，封闭液封闭，加入兔抗人EPO多克隆抗体（1∶200）结合，洗膜后加入HRP—羊抗兔IgG（1∶5000）结合，再次洗膜后加入Western Blot化学发光试剂，放置1 min后于暗室内用X光片进行化学发光自显影，洗片后采用图像分析仪扫描.
1.2.7 细胞免疫化学鉴定 将稳定转染pcDNA3—EPO的人脐血MSCs按5×105/L接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片. 24 h后弃掉培养基，细胞爬片用PBS洗2次，加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次. 采用兔抗人EPO多克隆抗体（1∶100），参照EliVisionTM Plus试剂盒说明进行细胞免疫化学染色. 实验对照组用未转染pcDNA3—EPO重组质粒的人脐血MSCs爬片直接进行细胞免疫化学染色.