鼠β
; 作者：魏晓丽, 施桥发, 李虹, 李婉宜, 蒋忠华, 李明远 毕业论文。
【关键词】; mBD2;,真核表达;,免疫荧光;,RT 毕业论文。
Cloning and eukaryotic expression of murine betadefensin2(mBD2); [Abstract]; AIM: To clone murine beta defensin2 gene (mBD2) and to express the mBD2 protein eukaryotically. METHODS: Total RNA was isolated from the lungs of BALB/c mice which were injected with LPS in advance. The DNA fragment encoding mBD2 was amplified by RTPCR and inserted into the plasmid pcDNA31(+), which was then digested with EcoRⅠand Xho I to construct the recombinant plasmid, pcDNA31(+)/mBD2. The pcDNA31(+)/mBD2 was; identified by endonuclease digestion, PCR, and sequencing analysis. The SiHa cells were transfected with; pcDNA31(+)/mBD2 plasmid and; screened; by G418 of 100 mg/L over 20 days.; Steady expression of mBD2; was confirmed by immunofluorescent staining; and RTPCR. RESULTS: About 250 bp DNA fragment was amplified by RTPCR from lung total RNA of the mice injected with LPS. The eukaryotic expression vector, pcDNA3.1(+)/mBD2, was successfully constructed after inserting the mBD2 fragment into pcDNA31(+). Most of SiHa cells transfected with pcDNA31(+)/mBD2 and screened; by G418 could express the mBD2 protein, confirmed by immunofluorescent staining and RTPCR. CONCLUSION: The eukaryotic vector of pcDNA31(+)/mBD2 was successfully constructed and transfected into SiHa cells, which; established a solid foundation for further study on the biological characteristics and antitumor mechanisms of the mBD2 protein. 毕业论文。
[Keywords]murine betadefensin2; eukaryotic expression; immunofluorescence; RTPCR 毕业论文。
[摘 要]; 目的: 对小鼠β防御素2（mBD2）基因进行克隆, 构建其真核表达载体, 筛选出稳定表达细胞株, 并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法: 通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS), 建立小鼠急性时相反应, 取其肺组织提取总RNA, 采用RTPCR方法扩增小鼠mBD2基因, 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（+）真核表达载体, 对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2转染SiHa细胞, 采用G418进行稳定表达株的筛选, 用免疫荧光染色和RTPCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果: 提取小鼠肺组织总RNA, 采用RTPCR方法扩增了250 bp左右的产物, 通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, 构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2。SiHa被该质粒转染后, 在100 mg/L G418浓度下筛选20 d, 得到了稳定表达mBD2的细胞株, 用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达, RTPCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论: 成功地构建了pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒, mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达, 这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。 毕业论文。
[关键词]mBD2; 真核表达; 免疫荧光; RTPCR ; 抗菌肽是天然免疫的重要介质, 具有广泛的抗菌和抗病毒活性, 是机体防御感染的重要因素。防御素是最早发现的抗菌肽之一, 分为4个类型: α防御素、 β防御素、 植物防御素和昆虫防御素[1]。其中, β防御素在组织中的表达具有特异性, 在局部黏膜免疫中起重要作用。鼠β防御素（murine beta defensin, mBD）2和3可以趋化未成熟的树突状细胞（DC）及CCR6转染的HEK293细胞[2]。采用DNA疫苗的研究方法也证明了mBD参与了获得性免疫应答。已有的研究还发现, mBD对大多数带负电荷的真菌、 支原体、 螺旋体等致病微生物均有攻击作用。高等动物的细胞由于存在高度发达的细胞骨架系统, ; 且细胞膜中负电荷较低而免受攻击。癌细胞由于生长旺盛故细胞骨架系统不发达, 这可能是防御素对癌细胞具有抑制作用的原因之一[3]。我们通过构建mBD2真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2, 将其转染HPV16（+）宫颈癌细胞株SiHa细胞, 并对转染细胞进行稳定筛选及分析鉴定蛋白的表达, 为研究mBD2蛋白在抗宫颈癌中的作用机制研究奠定细胞学基础。 毕业论文。
1; 材料和方法 毕业论文。
1.1; 材料; 选用4周龄BALB/c小鼠, 由四川大学华西医学实验动物中心提供。真核表达质粒pcDNA3.1(+)为本室保存, SiHa细胞株由四川大学华西医学中心免疫学教研室魏大鹏老师惠赠, 用RPMI1640细胞培养基（GIBCO公司产品）、 50 mL/L CO2条件下进行培养。LPS为Sigma公司产品, TRIZOL由Invitroge公司生产, 两步法RTPCR试剂盒为Fermentas公司产品, Premix Taq购自Takara公司, 胶回收试剂盒购自Omega 公司的E.Z.N.A GEL cycle Kit, 质粒提取使用Omega公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ。T4 DNA连接酶和限制性内切酶EcoRⅠ、 XhoⅠ均为Fermentas公司产品。引物合成由上海Invitroge公司完成。羊抗鼠mBD2抗体购自Santa cruz 公司, 荧光标记的兔抗羊IgG抗体、 辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体和封闭用兔血清均购自Fermentas公司, DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品, 真核转染试剂Lipofectamine购自Invitrogen公司。凝胶成像仪和Gelpro analyzer 4.0软件购自Media Cybernetics(USA).
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1.2; 方法 毕业论文。
1.2.1; mBD2总RNA的提取及cDNA合成; 以50 mg/g的剂量给BALB/c小鼠腹腔注射LPS, 12 h后颈脱臼处死小鼠, 无菌条件下分离小鼠肺组织, 提取肺组织总RNA[4]。取1 mL总RNA进行反转录, ; 反应条件为60℃ 5 min, 42℃ 60 min, 85℃ 2 min。RT过程中采用oligo(dT)引物进行反转录获得cDNA, 以备PCR产物的合成。
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1.2.2; PCR反应; 根据GenBank中查得的mBD2基因序列(基因登陆号AJ011800)设计扩增mBD2基因的引物, 上游引物为(下划线为酶切位点): ACGAATTCGAGTGCCCTTTCTACCAG（EcoRⅠ）, 下游引物为: CTCTCGAGACTTCCATGTGCTTCCTT（XhoⅠ）扩增产物长度为257 bp, 其中34~244 bp处为mBD2全基因序列。PCR反应条件为: 94℃预变性4 min, 94℃变性30 s, 54℃退火35 s, 72℃延伸30 s, 30个循环后72℃ 10 min终止反应。同时设立小鼠βactin基因作为扩增反应阳性对照, 其上游引物为: CCATGGATGACGATATCGCTGC, 下游引物为: GCTTCTCTTTGATGTCACGCACG, 扩增片段长度为669 bp。
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1.2.3; mBD2真核表达质粒的构建与鉴定; 对PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒DNA分别采用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收目的片段, 经T4 DNA连接酶在16℃将mBD2基因插入pcDNA3.1(+)质粒。连接产物转化JM109感受态细胞, 挑取Amp筛选的阳性克隆并采用PCR及EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定, 最后将PCR及双酶切鉴定正确的质粒送上海Invitroge公司测序, 并分析克隆基因序列组成及其阅读框架的正确性[5]。取构建正确的pcDNA3.1(+)/mBD2质粒转染SiHa细胞株。
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