同时产CTX?M?22及TEM?1型β?内酰胺酶的阴沟肠杆菌耐药性分析

【摘要】; 目的 了解临床分离阴沟肠杆菌株EC003产β?内酰胺酶的耐药特征和基因型。方法 采用琼脂二倍稀释法对阴沟肠杆菌EC003进行MIC检测，酶提取物三维实验检测AmpC酶，双纸片法筛选及确证实验检测超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)，等电聚焦(IEF)电泳测定其等电点。以耐药质粒为模板进行PCR扩增，将β?内酰胺酶全编码基因克隆、表达，并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果 阴沟肠杆菌株EC003对所试多数β?内酰胺类抗生素耐药，表型检测AmpC酶为阴性，ESBLs阳性，IEF显示该菌产两种pI分别为8.7及5.4的β?内酰胺酶。PCR扩增产物DNA测序证实为CTX?M?22、TEM?1型β?内酰胺酶全编码基因，产TEM?1的克隆菌株仅对青霉素类耐药，产CTX?M?22的克隆菌株对所试多数β?内酰胺类抗生素耐药，对头孢噻肟的水解程度明显强于头孢他啶。结论 临床分离阴沟肠杆菌株EC003同时产CTX?M?22和TEM?1型两种β?内酰胺酶，可导致对多数β?内酰胺类抗生素耐药。 毕业论文。

【关键词】; 阴沟肠杆菌 耐药性 β?内酰胺酶 表型 基因型 毕业论文。

; Characterization of a clinical isolate of Enterobacter cloacae 毕业论文。

ABSTRACT; Objective; To analyze the phenotype and genotype of extened?spectrum β?lactamases (ESBLs) produced by E.cloacae clinical isolate EC003.; Methods; E.cloacae EC003 was identified using the API20?E system and detected by three?dimensional extract test for AmpC β?lactamases and confirmatory test for ESBLs; antimicrobial susceptibility was determined with the standard agar dilution; isoelectric points (pIs) of β?lactamases were determined by isoelectric focusing (IEF); plasmid was extracted and genome DNA was sequenced by PCR amplification; the PCR products were cloned into pBK?CMV vector and the antimicrobial susceptibility of the clone strains were tested; the nucleotide and deduced protein sequences were also analyzed with the BLAST software of NCBI.; Results; E.cloacae EC003 produced two kinds of β?lactamases with pI value of 8.7 and 5.4 respectively; A 7kb plasmid was isolated from EC003, two gene fragments were obtained by PCR using the plasmid as template. The nucleotides and deduced protein sequences were identified as CTX?M?22 and TEM?1 type β?lactamases. The clone strain producing TEM?1 was resistant to ampicillin and piperacillin only, while the CTX?M?22 clone strain was resistant to most of β?lactams and much more active to hydrolysis cefotaxime than to ceftazidine.; Conclusions; The cause of the E.cloacae EC003 to develop resistance to most of β?lactams might be due to the simultaneous production of CTX?M?22 and TEM?1 type β?lactamases.收稿日期：2006?06?30 毕业论文。

阴沟肠杆菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常见病原菌，产生AmpC酶是其对β?内酰胺类抗生素耐药的重要机制。但近年来研究报道证实了产生超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)是造成阴沟肠杆菌对第三代头孢菌素耐药的另一重要原因，特别是产生多种β?内酰胺酶所致的耐药问题越来越受到人们的关注［1，2］。我们在研究川北医学院附属医院临床分离产ESBLs菌株的基因型时，发现阴沟肠杆菌EC003同时含有两种β?内酰胺酶，并分属其两大家族。现将研究结果报道如下。 毕业论文。

; 1; 材料和方法 毕业论文。

; 1.1; 材料。

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; 1.1.1; 菌株来源; 阴沟肠杆菌株EC003系川北医学院附属医院检验科分离，经法国Bio?Merieux公司API20?E系列鉴定菌种。E.coli JM109［F′traD36 proA+ proB+ lacIq lacZ△M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 supE44 relA1 △(lac?proAB) mcrA］由四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室惠赠，标准质控大肠埃希菌ATCC25922，标准质控肺炎克雷伯菌700603(产ESBL)由四川抗菌素工业研究所惠赠，TEM?1(pI5.4)和SHV?1(pI7.6)标准产酶菌由加拿大Queen′s大学医学院惠赠。

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; 1.1.2; 主要试剂; 头孢噻吩(cephalothin，CET)为吉林辉南长龙药业生产；氨苄西林(ampicillin，ABPC)和哌拉西林(piperacillin，PIPC)购自Roche公司；舒巴坦(sulbactam，SB)为吉林辉南长龙药业生产；头孢哌酮(cefoperazone，CPZ)、头孢噻肟(cefotaxime，CTX)、头孢唑林(cefazolin，CEZ)、头孢呋辛(cefuroxime，CXM)、和头孢他啶(ceftazidime，CAZ)由哈药集团制药总厂生产。三唑巴坦(tazobactam，TB)为哈尔滨誉衡药业产品；亚胺培南(imipenem，IMP)购自Merck Sharp Dohme(上海)公司；头孢吡肟(cefepime，CPE)和氨曲南(aztreonam，AZ)为Bristol?Myers Squibb(上海)公司产品；头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片、头孢他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片、头孢西丁纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；pI标准(pI4.45～9.6)和Biolyte(pH3～10)购自Bio?RAD公司；丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品；Taq酶、dNTP、RNase购自Gibco公司；DNA柱式胶回收试剂盒购自上海生工生物公司。

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; 1.1.3; 主要仪器设备; Universal 16R型台式高速冷冻离心机(Tuttlingen)，PTC?150型PCR仪(MJ Research公司，美国)，GDS?2000多功能凝胶成像和分析系统(美国)。 毕业论文。

; 1.2; 方法 毕业论文。

; 1.2.1; 药物敏感实验; 采用常规琼脂二倍稀释法，SB和TB的浓度固定为5mg/L。操作及结果判读按CLSI/NCCLS文件M100?S11(2001年版)进行。 毕业论文。

; 1.2.2; AmpC酶及ESBL表型鉴定; 采用KB(Kirby?Bauer)法，用头孢西丁纸片检测受试菌株，抑菌圈≤17mm疑为产AmpC酶，确证实验按Coudron报道的三维实验方法［3］；用头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片、头孢他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片进行ESBL表型鉴定筛选及确认，结果按CLSI/NCCLS文件M100?S11(2001年版)推荐标准文献判读。 毕业论文。

; 1.2.3; β?内酰胺酶等电聚焦(IEF)实验; 超声破壁法制备β?内酰胺酶粗提取液，pI判读采用浸有0.05% nitrocefin的滤纸染色，以标准产酶株作参照，并结合BioRad的等电点标准品考马斯亮蓝R250染色进行。具体操作依照文献［4］进行。 毕业论文。

; 1.2.4; 细菌质粒DNA提取与PCR扩增; 碱裂解法提取耐药质粒。编码框以外设计blaCTX?M?1组(P1：5′?CTGCGGATCCCATGGTTAAAAAATCA?3′，P2：5′?CTGCGAATTCTTACAAACCGTTGGTG?3′)及blaTEM(P3：5′?CTGCGGATCCCATGAGTATTCAA?CATTTC?3′，P4：5′?CTGCGAATTCTTACCAATG?CTTAATCAGT?3′)通用引物，所有引物5′分别引入EcoRI或BamHI酶切位点，由上海申能博彩公司合成。以EC003质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为，先94℃预变性3min，然后进入循环，循环参数为：94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，末次循环自动延伸7min。取5μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。 毕业论文。

; 1.2.5; PCR产物的纯化、克隆; 按照PCR产物纯化试剂盒(QIAgen)的要求，分别纯化目的基因片段，经EcoRI和BamHI酶切与经EcoRI和BamHI酶切后的pBK?CMV(含有卡那霉素抗性基因)连接。连接反应液转化至E.coli JM109感受态细胞，经含氨苄西林(50mg/L)/卡那霉素(50mg/L)的麦康凯培养基筛选。挑取白色菌落，接种于含氨苄西林的LB培养液中，37℃培养过夜。用碱裂解法提取克隆菌株中的质粒，经EcoRI和BamHI酶切鉴定，并测定克隆菌株对于多种β?内酰胺类抗生素的敏感性，提取克隆菌株产生的β?内酰胺酶并测定其对多种β?内酰胺类抗生素相对水解率［5］。 毕业论文。

; 1.2.6; 核苷酸序列测定及分析; PCR产物纯化后送上海基康生物公司测序，测序结果采用国际互联网上NCBI的BLAST工具进行同源性检索分析。

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