球形多孔支架材料体内血管化的量化分析
作者：马超，王臻，卢建熙，白峰，王林，袁伟，芦斌，陈国景。
【摘要】 ［目的］研究球形多孔β磷酸三钙（βTCP）支架植入体内后的血管形成情况。［方法］选择成年新西兰兔30只，随机分为5组，每只兔植入一个球形βTCP材料（直径2 cm，孔径500～600 μm，内连接径110～120 μm），于术后1、2、4、8、12周取材进行组织学观察、定量分析血管长入情况。［结果］术后1周未见新生血管。术后2周，支架外周见细小幼稚的血管。4周时，为血管化的第一个高峰，与2周比血管数量增加（P＜0.05）。8周时，血管数及直径增加，但无统计学意义（P＞0.05）。12周时，为第2次血管化高峰，见粗大成熟的血管，与其他时间比血管直径增大（P＜0.05）。［结论］血管化分阶段进行，即早期数量的增加和后期质量的提高。材料的结构和降解特性影响血管化。
【关键词】 支架材料； βTCP； 血管化； 量化； 组织形态测定术。
Abstract：［Objective］To explore the vascularization within spherical porous βTCP scaffolds in vivo.［Method］Thirty adult rabbits were selected and divided into 5 groups randomly.Spherical porous βTCP scaffolds(the diameter was 2 cm,the pore size was 500～600μm,the interconnection size was 110～120 μm) were harvested at 1,2,4,8 and 12 weeks after embedded into musclefascia lumbodorsalis pouches in each rabbit separately,in order to observe the vascularization by means of morphological and quantificational analysis.［Result］No vessel was detected at one week after surgery,and only a few immature vascular buds could be seen at the 2nd week.The first vascularization peak could be observed at 4 weeks,characterized by the growth of quantity of new blood vessels(P＜0.05).At 8 weeks,vasculature reform happened due to relative insufficient supply of oxygen and nutrition,showing the enlargement of new vessels‘d iameters.At 12 weeks,the 2nd vascularization peak was shown that the diameter of new vessels increased(P＜0.05)and mature vessels had thick walls and little branches,while the numbers of vessels remained stable(P＞0.05).［Conclusion］The process of vascularization comprises two phases,the quantity increasing in the early stage and the quality enhancing in the later stage.The special architecture and biodegradation characters of scaffolds could influence the vascularization.
Key words：scaffold; βTCP; vascularization; quantification; histomorphometry。
迅速而有效的血管化是支架材料内部细胞成活、分化，进而成骨，修复骨缺损的先决条件。因为血管化不足，目前构建的组织工程骨多在5 mm×5 mm×5 mm以内，难以满足修复大段骨缺损的需要［1］。大量研究［2～5］通过优化材料的三维结构来促进血管化，认为多孔材料内部的孔径、内连接径、空隙率与血管的长入有密切的关系，但具体过程还未探明。本实验将一种直径为20 mm的球形多孔支架，不复合细胞或促血管生成因子，植入动物体内，量化分析特定空间结构下的血管化规律，为临床实践提供理论依据。
1 材料与方法。
1.1 材料与器械。
球形多孔支架材料（上海贝奥路生物材料有限公司），成分为β磷酸三钙（βTCP），纯度95%，由βTCP粉末,经＞1 100 ℃高温烧结而成。规格为：直径2 cm球体，具有内部连通的三维结构，孔隙率为(70±15)％，孔径500～600 μm,孔型为分布均匀的球形，孔壁光滑，连接径为110～120 μm，孔隙连通率＞99％，力学强度＞2 MPa。Leica 1600硬组织切片机(德国Leica公司)，Leica MTLA专业级显微镜(德国Leica公司)，Pixera Pro600CL冷光源数码摄象头(美国Pixera公司)。
1.2 实验动物及手术。
成年新西兰白兔30只（由第四军医大学实验动物中心提供），体重2.5～3.0 kg，均为雌性，随机分为５组，每只植入1枚材料。
按文献报道［2,6］，速眠新I号（军事医学科学院军事兽医研究所）0.2 ml/kg肌肉注射麻醉,常规消毒铺单。取背部正中纵行切口,长约5～6 cm，游离一侧皮下，显露腰背筋膜,保护腰背动脉。在肩胛下角内下方距离正中线约2 cm处纵向切开腰背筋膜,深至肌层表面,切口长约２～3 cm,在腰背筋膜与肌膜之间钝性分离,将球形材料置入其中，缝合切口，止血、清洗伤口后逐层关创。术后常规预防感染。术后1、2、4、8、12周分别取材观察。
1.3 组织切片及形态学观察。
术后1、2、4、8、12周处死实验兔，取材，10%甲醛(pH=7.2)固定14 d，淋洗、脱水，甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)包埋，置4℃冰箱自然凝固。连续平行切片，取直径为（20±1） mm的切片（过球体中心，即中截面），厚约200 μm。磨片至约50 μm，抛光，Van Gieson′s苦味酸—品红染色，定性观察。
1.4 组织形态测定。
16倍镜下在随机设定的x、y轴取4个区域，50倍镜下在上述四个区域中随机取4个视野，用Leica MTLA全自动专业研究级显微镜(德国Leica公司) 进行图像采集，得到16张图片。以细长内皮样细胞形成的腔隙结构判断为新生血管。
测量参数：(1)血管数；(2)血管直径；(3)组织长入深度比例（proportion of tissue penetration,PTP）%=组织长入深度/材料半径(4)血管相对百分比(relative vessel percentage，RVP)%=血管面积/新生组织面积16个视野。最后的数据求均值为此切片的相应参数值。
1.5 统计学处理。
数据以±s表示，经SPSS 11.0软件处理。各个参数的随时间变化的差异用完全随机设计的单因素方差分析（oneway ANOVA）,时间点之间行多重比较（LSDt检验）。血管参数与组织参数之间的关系用Pearson相关检验分析。P0.05时差异有统计学意义。
2 结 果。
2.1 大体观察。
切口愈合良好，未见渗出、坏死。4周时球体与周围组织紧密粘连，切开见组织向心性生长，有出血点； 12周时球体边缘变毛糙，体积缩小。
2.2 形态学观察。
术后1周，材料外周约1个大孔范围内可见大量红细胞渗入，伴少量炎细胞，无新生血管。2周时组织长入约3个大孔的范围，可见单层内皮细胞围成腔隙样的幼稚血管，通过内连接孔穿行（图1a）。4周时，组织向心性长入约6个大孔范围，可见大量的新生血管，穿过多个孔隙，互相沟通成网。材料外周血管较粗，越靠中心越细（图1b）。8周时，组织长入约7～8个大孔范围，细胞增多，以成纤维细胞为主。血管数量变化不大，但血管变粗，管壁圆润，管腔内可见大量红细胞团。材料外周大孔孔壁断裂、崩解，可见吞噬材料颗粒的巨噬细胞（图1c）。12周时，组织长入约8～9个大孔范围，外周孔隙完全被新组织填充。多见粗大成熟的血管，但穿过内连接孔时变细，与内连接孔大小相当（图1d）。