HCN4基因在风心二狭心房纤颤患者心房组织中mRNA表达初探

作者：周华富，杨涛，冼磊，冯旭，陈铭伍。

【摘要】 目的 通过分析风湿性心脏病二尖瓣狭窄患者心房肌组织HCN4基因表达与心房颤动发生的关系，为风心二狭房颤发生机制奠定理论基础。方法 取手术患者心耳组织100 mg，提取RNA后应用半定量逆转录－PCR方法检测mRNA含量，并对PCR产物测序分析。以HCN4基因mRNA和内参β—actin含量的比值作为评价HCN4基因mRNA表达水平指标。结果 测定HCN4基因cDNA 序列同源性为100%。试验组及对照组HCN4基因mRNA与β—actin含量的相对表达值比值（±s）分别为0.696±0.257和0.125±0.010，两组比较，差异有显著性(P0.01）。结论 HCN4基因的过度转录表达可能参与了调控风心二狭房颤的发生过程，揭示了HCN4基因作用的分子机制。

【关键词】 HCN4基因；风心二狭；心房纤颤；序列测定。

Increased atrial expression of HCN4 gene mRNA in atrial fibrillation patients with mitral stenosis of rheumatic heart disease。

［Abstract］ Objective By analyzing the relationship between the atrial fibrillation patients of mitral stenosis of rheumatic heart disease and HCN4 gene in muscles of right atrium，constructing the theorical basis of development of atrial fibrillation ocurring in mitral stenosis of rheumatic heart disease.Methods Semi—quantitative reverse transcription—PCR(RT—PCR） was used to detect and quantify the mRNAs of HCN4 gene in the atria of two groups with atrial fibrillation(thirty eight patients） or without atrial fibrillation(fourteen patients），then we analysised the sequence of PCR products of HCN4 gene，evaluated of HCN4 gene mRNA with the ratio of starting quantity of HCN4 gene and house—keeping gene β—actin.Results HCN4 genes homology was 100 percent with the BLAST process in genebank of NCBI.The relative expression value （±s） in experimental group and control group was repective 0.696±0.257 and 0.125±0.010，mRNA of HCN4 gene in ataria increased significantly compared with control group (P0.01）.Conclusion The overexpression of HCN4 gene might participate in the progress of atrial fibrillation development in mitral stenosis of rheumatic heart disease，which reveals the molecular mechanism of one function of HCN4 gene.

［Key words］ HCN4 gene；mitral stenosis of rheumatic heart disease；atrial fibrillation；sequence analysis。

HCN4基因属于超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族（HCN），参与编码超极化激活阳离子电流（If）通道结构蛋白，是心脏动作电位的缓慢的舒张期自动去极化激活的一个重要组成部分，参与窦房结细胞自发性舒张期膜去极化过程，具有调控起搏的功能。心房颤动（atrial fibrillation，Af）为风湿性心脏病二尖瓣狭窄最常见和严重的并发症之一，合并房颤患者的病死率是无房颤患者的2倍。目前对风心二狭心房纤颤发病机制的研究已进入分子水平。HCN4基因突变可能与病态窦房结综合征（sick sinus syndrome，SSS），Af等多种心律失常相关。1999 年 Ludwing等［1］在筛查cDNA文库时，通过探针发现HCN4基因的cDNA。随后，Seifert等［2］从人类丘脑cDNA文库中使用PCR技术和重组体质粒构建成功克隆出HCN4基因。2003年，Stieber等［3］又通过原位杂交和免疫组织化学分析，发现HCN4基因在发育中的胚胎心脏上高表达。

本研究中测定风心二狭房颤患者HCN4基因部分序列，并根据此序列采用RT－PCR法从mRNA水平分析HCN4基因在风心房颤二狭患者表达改变，为风心二狭房颤发生机制奠定理论基础。

1 材料与方法。

1.1 临床标本 病例来源于我院2007年3月～2008年3月进行二尖瓣置换术的风湿性二尖瓣狭窄患者52例，以是否并发心房颤动分为试验组和对照组。试验组患者38例，男18例，女20例，年龄26～68岁，平均（48±11）岁。对照组患者14例，男6例，女8例，年龄21～62岁，平均（44±13）岁。全部标本均为术中获取右心耳心肌标本约100 mg，取材后速冻于液氮中，—80 ℃超低温贮存备用。

1.2 主要的试剂和仪器 RNAsimple Total RNA Kit(总RNA提取试剂盒，TIANGEN公司，北京），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(逆转录试剂盒，Fermentas公司，美国），TaKaRa Ex TaqTM(TaKaRa公司，大连），dNTP Mixture(TaKaRa公司，大连），柱式PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN公司，德国），Thermo PXE0.2 PCR扩增仪(Thermo公司，美国），3730XL DNA分析系统(ABI公司，美国），紫外分光光度计（UVC—515，美国），水平凝胶电泳槽（BIO—RAD公司，美国），凝胶数字成像仪（BIO—RAD公司，美国）。

1.3 引物的设计及合成 参考GenBank中人HCN4基因(NM_005477）和β—actin(NM_001101）基因的核苷酸序列，在保守区域分别设计特异性引物，HCN4基因扩增片段长度为233 bp；β—actin扩增片段长度为186 bp。引物由大连宝生物公司合成，两个基因的引物序列分别如下：HCN4基因:上游引物:5’—CCCGCCTCATTCGATATATTCAC—3’，下游引物:5’—GAGCGCGTAGGAGTACTGCTTC—3’；β—actin:上游引物:5’—TGGCACCCAGCACAATGAA—3’，下游引物:5’—CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA—3’。

1.4 RNA提取及RT－PCR半定量分析目的基因 按总RNA提取试剂盒（RNAsimple Total RNA Kit）说明书提取总RNA，溶于DEPC处理的去离子水中，—70 ℃保存备用。应用紫外分光光度计检测，A280/A260≥1.8为合格。所提取的总RNA经1.5%，琼脂糖凝胶电泳鉴定，证明其完整性。取总RNA 3μg进行逆转录反应，步骤按逆转录试剂盒（Fermentas公司，美国）操作说明书进行，逆转录的cDNA置—20 ℃保存。逆转录反应体系及条件：RNA 3 μg，oligo(dT）18 primer(0.5 μg/μl）1 μl，加DEPC处理的去离子水至12 μl，振荡混匀3～5 s，70 ℃ 5 min；加入5×reaction buffer 4 μl，RiboLockTM Ribonuclease inhibitor(20 u/μl） 1 μl，10 mM dNTP mix 2 μl，轻微振荡、离心，37 ℃ 5 min；加入 RevertAidTM M—MuLV Reverse Transcriptase(200 u/μl）1 μl至总体积20 μl，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，置入冰中。50 μl PCR体系中含DNA模板2 μl，TaKaRa Ex Taq 0.25 μl，dNTP Mixture 4 μl，10×Ex Taq Buffer 5 μl，Forward Primer和Reverse Primer分别为1 μl(20 mM）和1 μl(20 mM），加DEPC水36.75 μl至50 μl。反应条件为:94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增40个循环。扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计检测结果并摄像，凝胶电泳图像应用Biosens image analysis system分析电泳条带灰度值，mRNA表达的相对强度＝目的基因条带灰度值／β－action条带灰度值，以两者比值作为目标基因的相对表达含量。

1.5 HCN4基因PCR产物测序 PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，采用QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒按说明进行胶回收纯化，PCR产物测序按常规方法［4］进行。

1.6 统计学处理 应用SPSS16.0(USA）软件进行统计学分析，各组计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间数据比较采用独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。